尹蘭蘭，汪晨曦，馬天仲

早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是育齡婦女常見的疾病之一。在POI患者中，卵巢功能隨著年齡的增長而下降，其特征是卵泡數(shù)減少和月經(jīng)周期停止。POI的總患病率為1%，其中絕經(jīng)后婦女的患病率為3.7%[1]。目前，POI患者有效的生育治療方法是利用年輕女性的卵子進行體外受精和胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET），然而在我國因卵子來源受限和倫理等問題難以開展。近年來，基于Hippo通路和磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（PI3K-AKT）通路對卵巢始基卵泡的重要調(diào)控作用，卵巢皮質(zhì)片的體外激活（in vitro activation，IVA）方法為POI患者的不孕不育提供了新的治療技術(shù)。本文旨在簡述在IVA技術(shù)中PI3K-AKT和Hippo信號通路對始基卵泡激活的調(diào)控作用，并綜述IVA治療POI的現(xiàn)狀及研究進展。

1 POI

POI是指患者發(fā)生在40歲以前的卵巢功能喪失，以月經(jīng)紊亂（閉經(jīng)或少經(jīng)）、卵泡刺激素（FSH）水平升高和雌二醇（E2）水平降低為特征并伴有不同程度圍絕經(jīng)期表現(xiàn)的臨床綜合征。2016年歐洲人類生殖與胚胎學(xué)會（ESHRE）提出POI的診斷標準是：①少經(jīng)或閉經(jīng)4個月以上；②連續(xù)2次檢查（間隔＞4周）FSH＞25 U/L[2]。POI是一種有多種病因的綜合征，其可能涉及的發(fā)病因素有遺傳（X染色體及常染色體的突變等）[3]和自身免疫因素[4]等。此外，醫(yī)源性因素（卵巢手術(shù)、放化療干預(yù)）也可能導(dǎo)致POI。實際上對于大多數(shù)表現(xiàn)為POI的患者，其發(fā)病因素仍無法解釋[5]。POI患者可通過激素替代治療改善提前出現(xiàn)的圍絕經(jīng)期癥狀（閉經(jīng)和低雌激素狀態(tài)）[6]。對于有生育要求的患者，可實施早期診斷、提前保護，采用個體化的激素療法以及促排卵、卵子冷凍技術(shù)和IVF-ET等措施。研究表明，部分被診斷為POI患者的卵巢皮質(zhì)中仍保留著一定數(shù)目不受促性腺激素調(diào)控的處于休眠狀態(tài)的始基卵泡。所以，該部分POI患者不能或很難通過常規(guī)的輔助生殖技術(shù)獲得成熟可受精的高質(zhì)量卵子[7]。因此，激活休眠的始基卵泡生長發(fā)育，獲得成熟的卵子用于輔助生殖技術(shù)將成為保存POI患者生育力和成功妊娠的新方法。而如何激活始基卵泡則需要從調(diào)控卵泡發(fā)育及成熟的機制入手。

2 調(diào)控始基卵泡激活的通路

女性的基本生殖單位是卵泡，可以認為卵巢儲備是由出生時的始基卵泡組成的一個固定池，在卵泡激活或閉鎖的過程中逐漸減少。卵泡在卵巢內(nèi)精密有序的發(fā)育、成熟過程是高度連續(xù)、完整的。始基卵泡形成以后，在一定時期內(nèi)僅有一小部分始基卵泡進入生長發(fā)育階段，經(jīng)過始基卵泡、初級卵泡、次級卵泡、有腔卵泡，最后發(fā)育為成熟的排卵前卵泡。其余大部分始基卵泡可以在卵巢內(nèi)處于休眠狀態(tài)并持續(xù)數(shù)十年。始基卵泡激活就是始基卵泡向初級卵泡轉(zhuǎn)化的過程，分為兩個階段：首先圍繞在初級卵母細胞周圍的前體顆粒細胞增殖，形態(tài)由單層梭形轉(zhuǎn)化為立方上皮；然后卵母細胞體積開始增大，顆粒細胞繼續(xù)增殖[8]。始基卵泡激活的調(diào)控機制包括以下3個方面[9]，①外部環(huán)境：卵泡微環(huán)境中含有大量自分泌和旁分泌生長因子，這些因子激活了始基卵泡顆粒細胞（primordial follicle granulosa cells，pfGCs）中的特殊信號通路，進而觸發(fā)休眠卵泡；②卵泡膜細胞和卵母細胞之間的通訊：由pfGCs分泌的各種激素和生長因子影響卵母細胞的發(fā)育，而卵母細胞的質(zhì)量反過來影響顆粒細胞的質(zhì)量和數(shù)量，從而決定卵泡的激活、發(fā)育和凋亡；③物理和機械因素：卵巢組織的機械刺激有助于始基卵泡的激活，如解除細胞接觸抑制和改變卵巢組織密度梯度。盡管激活始基卵泡的確切機制尚不清楚，但最近的研究表明，PI3KAKT信號通路和Hippo信號通路在始基卵泡激活中發(fā)揮重要的作用[10]。

2.1 PI3K-AKT信號通路 PI3K-AKT信號通路是體內(nèi)的基礎(chǔ)信號通路，可調(diào)控細胞代謝、增殖和存活等多種細胞功能。近來，PI3K-AKT信號通路已被證實在卵母細胞內(nèi)對維持始基卵泡生長和閉鎖具有重要的意義[11]。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O3（FOXO3）是AKT途徑下游轉(zhuǎn)錄抑制因子，其是卵泡靜止的重要調(diào)節(jié)劑，起到抑制卵泡生長的作用。AKT活化導(dǎo)致FOXO3磷酸化并易位到細胞質(zhì)從而解除其抑制作用，引起卵泡活化。當(dāng)AKT失活后，F(xiàn)OXO3去磷酸化回到細胞核內(nèi)，反式激活靶基因，從而抑制卵泡的活化、成熟[12]。人類第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）可拮抗PI3K-AKT-FOXO3信號通路，使4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）向3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）的轉(zhuǎn)化受到抑制，從而阻斷AKT活化。PTEN基因沉默時，卵巢內(nèi)更多的始基卵泡發(fā)育為初級卵泡，而始基卵泡的數(shù)量減少[13]。特異性敲除小鼠卵母細胞中的FOXO3或PTEN時，都可導(dǎo)致始基卵泡出現(xiàn)過度生長并提前活化，導(dǎo)致幼年小鼠出現(xiàn)卵泡耗竭[14-15]。2010年，體外AKT激活劑（包括PTEN抑制劑和PI3K激活劑）培養(yǎng)被用于激活小鼠休眠卵泡。通過增加AKT活性來激活休眠的始基卵泡，從而導(dǎo)致始基卵母細胞中FOXO3a磷酸化并易位到細胞質(zhì)。小鼠卵巢移植后，始基卵泡發(fā)育至排卵前階段，將獲得的成熟卵母細胞用于IVF-ET后分娩出健康的幼崽[16]。而且在長期隨訪中證實了其子代的正常性，未發(fā)現(xiàn)生殖活動異常和慢性疾病增加[17]。

除此之外，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1（mTORC1）作為一種高度保守的絲/蘇氨酸激酶，也是已知的通過PI3K-AKT途徑激活小鼠始基卵泡的介質(zhì)，抑制mTORC活性是維持始基卵泡休眠的先決條件[18]。mTORC1活性受到結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物1/2（TSC1/2）的負調(diào)控，腺苷酸活化蛋白激酶（AMP activated protein kinase，AMPK）抑制劑可抑制小鼠TSC2的活性，從而誘導(dǎo)mTORC以及下游核糖體蛋白S6（RPS6）磷酸化，進而導(dǎo)致始基卵泡的激活[19]。使用mTORC信號通路特異性激活劑聯(lián)合AKT激活劑處理后的卵巢組織可以進一步提高卵泡激活的成功率并成功獲得子代小鼠[20]。

2.2 Hippo信號通路 Hippo信號通路最早發(fā)現(xiàn)于果蠅中，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)Hippo信號通路在哺乳動物和人類體內(nèi)也廣泛存在，且高度保守。哺乳動物中Hippo信號通路的核心激酶級聯(lián)MST1/2、SAV1、LATS1/2和MOB1四種腫瘤抑制因子，作用于Hippo途徑下游的轉(zhuǎn)錄共激活因子Yes相關(guān)蛋白（YAP）/轉(zhuǎn)錄共激活因子PDZ結(jié)合基序（TAZ）[21]。Hippo通路的激活磷酸化了轉(zhuǎn)錄共激活因子YAP/TAZ，并導(dǎo)致YAP/TAZ保留在細胞質(zhì)中與14-3-3蛋白結(jié)合或被蛋白酶體降解。當(dāng)Hippo通路失活時，YAP/TAZ去磷酸化，可自由轉(zhuǎn)運至細胞核與TEAD轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而促進下游靶基因的表達[22]。Hippo信號通路在控制器官生長和再生方面發(fā)揮核心作用，受多種生化、物理和結(jié)構(gòu)信號的影響，包括機械信號、細胞極性、細胞-細胞黏附、激素、生物活性化學(xué)物質(zhì)和細胞應(yīng)激[23]。2013年Kawamura等[24]觀察到在卵巢中激活Hippo信號通路可特異性地抑制卵泡激活。研究顯示，通過將小鼠卵巢皮質(zhì)碎裂成小方塊，有助于球狀肌動蛋白（G-肌動蛋白）聚合為絲狀肌動蛋白（F-肌動蛋白）。F-肌動蛋白阻斷Hippo信號通路，增加細胞核內(nèi)YAP蛋白含量，核YAP與共轉(zhuǎn)錄因子TEAD1/2/3/4相互作用以刺激下游CCN生長因子和BIRC凋亡抑制劑的表達，促進卵泡活化和生長[25]。2015年該團隊還證明了組成型活性YAP轉(zhuǎn)基因的過表達促進了人和小鼠卵巢移植物中的卵泡生長[26]。研究表明，卵巢局部損傷（活檢或搔刮）能破壞Hippo信號通路從而促進卵泡生長。Zhang等[27]對80例POI患者行腹腔鏡下左側(cè)卵巢活檢和右側(cè)卵巢刮傷，術(shù)后激素替代治療6個月并觀察卵泡生長情況，結(jié)果顯示11例患者恢復(fù)卵巢功能；在10例患者中回收了3枚處于第二次減數(shù)分裂中期（MⅡ期）的卵母細胞，其中1例患者移植2枚新鮮胚胎，最終活產(chǎn)1例健康嬰兒。以上方法都是通過機械信號刺激卵巢從而干擾Hippo信號通路，促使卵巢休眠途徑失活，使卵泡進入生長發(fā)育的軌道（IVA）[28]。Hu等[9]通過檢測小鼠卵巢IVA前后始基卵泡中核心成分的定位和表達，發(fā)現(xiàn)IVA培養(yǎng)8 d后的小鼠卵巢中MST1和LATS2表達下降，而YAP1表達增加。始基卵泡的激活伴隨著Hippo信號通路的減弱，這進一步證實了Hippo通路參與始基卵泡的激活。

2.3 Hippo和PI3K-AKT信號通路交聯(lián)作用于卵泡激活 Hippo和PI3K-AKT信號通路在其他組織器官和細胞之間存在頻繁的交叉“對話”。如TAZ通過抑制PI3K-AKT信號促進骨質(zhì)疏松大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化[29]。Hippo信號通路可直接通過YAP激活嚙齒類動物心肌細胞PI3K或通過微小RNA（miRNA）抑制PTEN的表達來誘導(dǎo)PI3K-AKT通路激活[30]。研究發(fā)現(xiàn)YAP受到機械刺激和生長因子的信號刺激后，能進入上皮細胞胞核促進細胞增殖并通過PI3K-3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）-AKT途徑發(fā)出信號[31]。已知PI3K-AKT和Hippo信號通路在始基卵泡激活中發(fā)揮著重要的作用，但它們之間互相串?dāng)_作用于卵巢始基卵泡活化的具體機制尚未明確。Devos等[32]研究發(fā)現(xiàn)對小鼠卵巢片段化處理不僅作用于Hippo通路，對PI3K-AKT通路也有影響。小鼠卵巢片段化處理刺激了PI3K途徑，導(dǎo)致AKT和RPS6磷酸化增加，提示在卵巢中Hippo和PI3K-AKT途徑之間存在交叉“對話”，兩者相互作用誘導(dǎo)體外卵泡激活。而且mTORC1抑制劑可減弱兩種途徑的激活作用，起到防止卵泡過度激活、保護卵巢儲備的作用[33-34]。研究發(fā)現(xiàn)AKT抑制劑（MK2206）抑制始基卵泡活化的同時也增強了Hippo通路的活性，但是在轉(zhuǎn)染YAP過表達慢病毒載體的小鼠卵巢中AKT和p-AKT水平無明顯變化。此外，YAP1上調(diào)部分緩解了AKT下調(diào)對始基卵泡活化的抑制作用，表明AKT可能是Hippo通路的上游調(diào)控元件[9]。同時提示AKT作為PTEN-PI3K和TSC-mTOR途徑的連接點，可將Hippo途徑與PI3K-AKT和TSC-mTOR途徑聯(lián)系起來。作用于卵巢卵泡激活的信號通路是極為廣泛的，包括Hippo、PI3K-AKT、TSC-mTOR和轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）等途徑，它們之間相互串?dāng)_共同調(diào)控著始基卵泡的激活。了解卵巢中信號通路的相互作用，有助于我們從整體水平理解卵泡激活的機制。

3 IVA應(yīng)用于POI患者的臨床進展

利用PI3K-AKT和Hippo途徑對卵泡激活和生長的影響，Kawamura等[24]和Suzuki等[35]開發(fā)了一種控制始基卵泡激活的方法來治療POI，并將其命名為IVA，即通過AKT激活劑體外培養(yǎng)卵巢片段，并通過卵巢皮質(zhì)的碎裂來破壞Hippo信號傳導(dǎo)途徑，從而激活休眠的始基卵泡，結(jié)合常規(guī)輔助生殖技術(shù)已成功分娩健康嬰兒。研究共招募37例POI患者，其中9例患者（24%）有卵泡生長，最終分娩2例健康嬰兒[35]。隨后，2016年，Zhai等[36]報告14例POI患者摘除一側(cè)卵巢后IVA 2 d，并在其中一側(cè)輸卵管漿膜下進行卵巢組織移植。該過程不需要卵巢玻璃化冷凍，這避免了冷凍保存可能導(dǎo)致的卵泡損失，結(jié)果顯示14例患者中6例（43%）有卵泡發(fā)育，并成功分娩1個健康嬰兒。雖然IVA已經(jīng)少量應(yīng)用于臨床并且有成功分娩案例，但仍有不少學(xué)者質(zhì)疑IVA技術(shù)在臨床實踐中的功效與安全性。由于IVA過程涉及IVA藥物（AKT激活劑）的使用，IVA藥物的致癌性或其他有害作用是臨床需要考慮的。最近研究表明，通過PTEN抑制劑激活PI3K-AKT通路導(dǎo)致始基卵泡的活化可能會損害正在生長的卵泡的發(fā)育[37]，而卵泡活化也是卵巢組織移植后卵泡丟失的直接重要原因[38]。有學(xué)者表示，卵巢組織玻璃化冷凍并結(jié)合PI3K激活劑體外培養(yǎng)會嚴重損害卵泡儲備[39]。對于早期POI患者，由于卵巢中殘留有次級卵泡，單獨的機械刺激（Hippo通路破壞）足以促進卵泡生長[40]。Fabregues等[41]對1例32歲的POI患者行腹腔鏡下卵巢部分皮質(zhì)切除術(shù)，未經(jīng)組織培養(yǎng)（無藥物IVA）情況下，將卵巢皮質(zhì)碎片化后移植到對側(cè)卵巢和卵巢附近的腹腔中。手術(shù)后，通過促性腺激素釋放激素激動劑（GnRHa）和人絕經(jīng)期促性腺激素（HMG）誘導(dǎo)3枚成熟卵泡的生長，取卵后常規(guī)行IVF-ET，患者成功受孕。隨后，該團隊對14例POI婦女進行無藥物IVA治療，有7例患者檢測到卵泡發(fā)育，其中4例患者已成功妊娠[42]。無藥物IVA避免了移植組織體外與IVA藥物孵育的步驟，是一種介入創(chuàng)傷較少的治療手段。

4 結(jié)語

未來隨著人們對調(diào)節(jié)卵泡生長發(fā)育的具體作用機制的深入了解及研究，探索調(diào)控始基卵泡激活的多種信號通路及分子之間的相互串?dāng)_，可期待找出更多具有高效性及安全性的藥物和方法（如體內(nèi)局部藥物的應(yīng)用或精制/標準化卵巢機械損傷技術(shù)）為患者提供保留生育力的新選擇。盡管已經(jīng)有健康嬰兒通過IVA技術(shù)出生，但仍需要更多的研究旨在優(yōu)化IVA技術(shù)、提升IVA效率并降低其可能帶來的潛在危險以確保本IVA程序的安全性。