柏林，楊曉葵

卵巢衰老是指女性卵巢儲備功能逐漸衰退直至衰竭的過程，表現(xiàn)為卵泡數(shù)量減少和卵母細胞質量下降，從而影響卵巢內分泌功能和生育能力。卵巢衰老受年齡、遺傳、免疫、醫(yī)源性、社會環(huán)境等多因素影響，包括生理性卵巢衰老和病理性卵巢衰老[1]。生理性卵巢衰老是受年齡影響卵巢功能自然老化的過程。卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）、早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）等是病理性卵巢衰老。隨著分子技術的發(fā)展，卵巢衰老分子機制的研究不斷深入，涉及基因突變、細胞凋亡、氧化應激等方面，其中非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）作為功能性RNA分子，在卵巢細胞分化、增殖、凋亡中發(fā)揮重要作用，為研究卵巢衰老提供了新的思路。

1 ncRNA概述

ncRNA是指不編碼蛋白質的功能性RNA分子，人類基因組中只有1.5%的序列能編碼蛋白質，有多達80%的基因組序列為ncRNA，不參與蛋白質的翻譯[2]。ncRNA作為介導細胞調控的功能性分子，參與細胞信號傳導通路，影響細胞分化、增殖、凋亡等過程，在生長發(fā)育、疾病發(fā)生及發(fā)展中起著重要的調節(jié)作用。根據(jù)其功能特點，ncRNA分為兩類：管家ncRNA（housekeeping ncRNA）和調節(jié)ncRNA（regulatory ncRNA）。管家ncRNA在所有細胞中均表達，維持細胞基本功能，主要包括核糖體RNA（rRNA）、轉運RNA（tRNA）、核小RNA（snRNA）和核仁小RNA（snoRNA）等。調節(jié)ncRNA在基因表觀遺傳、轉錄及轉錄后水平參與調控，主要包括長鏈ncRNA（lncRNA）、 微 小RNA （miRNA）、 環(huán) 狀RNA（circRNA）、小干擾RNA（siRNA）和piRNA（piwiinteracting RNA）等[3]。

2 ncRNA與卵巢功能

卵巢內的miRNA、lncRNA和circRNA等非編碼RNA可通過調控其相應的靶基因和信號轉導通路影響卵泡發(fā)育、排卵與閉鎖，并參與卵巢局部激素的合成與分泌。

2.1 ncRNA對卵泡發(fā)育的調控卵巢細胞中存在的多種ncRNA參與卵泡募集、選擇、排卵等過程。Sontakke等[4]通過牛卵泡發(fā)育miRNA微陣列研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與優(yōu)勢卵泡的選擇，優(yōu)勢卵泡中btamiR-144、bta-miR-202、bta-miR-451、bta-miR-652和bta-miR-873的表達高于小卵泡。另有研究發(fā)現(xiàn)在排卵障礙女性血清中miR-200b 和miR-429表達水平更高，應用外源性促性腺激素促排卵治療后可使二者水平下降至正常排卵女性水平[5]?？姑缋展芗に兀╝nti-Müllerian hormone，AMH）通過結合AMH受體Ⅱ型（Amhr2）在卵泡生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用，而lncRNA-Amhr2可增加Amhr2啟動子活性，激活其在小鼠卵巢顆粒細胞中的表達[6]。Bouckenheimer等[7]發(fā)現(xiàn)人MⅡ期卵母細胞中高表達的lncRNA BCAR4、C3orf56、TUNAR、OOEP-AS1、LINC01118和CASC18，參與染色質重構、細胞多能性和早期胚胎發(fā)育，卵丘細 胞 中 的lncRNA MEG3、MALAT1、TUG1、MIAT、PANDAR 和PVT1參與調控卵泡發(fā)育早期細胞骨架形成和細胞間黏附。

circRNA在卵母細胞成熟中發(fā)揮重要作用。circARMC4調控豬卵母細胞減數(shù)分裂成熟和早期胚胎發(fā)育，卵丘細胞中特異性表達的circRICTOR下調會導致卵丘擴大失敗，影響卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育[8]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白15（bone morphogenetic protein 15，BMP15）和生長分化因子9（growth differentiation factor 9，GDF9）是卵母細胞分泌的兩種生長因子，二者可通過circ_n/a_75調節(jié)miR-339a，circ_n/a_303調節(jié)miR-2400和miR-30c，抑制相應基因表達，影響豬卵泡發(fā)育和卵母細胞成熟[9]。

2.2 ncRNA與卵巢激素合成ncRNA不僅能調節(jié)卵泡發(fā)育，還能影響激素合成與分泌以及黃體形成。miR-7a2的遺傳缺失會導致雌性小鼠不育、促性腺激素和類固醇激素水平降低，miR-7a2通過對垂體前列腺素和BMP4信號通路的影響，調控卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）和黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）的合成和分泌[10]。一項研究通過對牛卵泡和黃體組織進行微陣列分析發(fā)現(xiàn)miR-96通過靶向作用于叉頭轉錄因子1（forkhead box O1，F(xiàn)OXO1）介導黃體發(fā)育和孕酮生成[11]。miR-210可通過下調芳香化酶基因Cyp19a1、增殖細胞核抗原基因（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）和癌基因HRas抑制水牛卵巢顆粒細胞的增殖，抑制EFNA3（ephrin A3）表達促進血管生成，為顆粒細胞分化和黃素化做準備[12]。

lncRNA H19的缺失會阻斷小鼠卵巢中類固醇合成快速調節(jié)蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，STAR）的產生，影響孕激素的合成[13]。lncRNA類固醇受體RNA激活劑（lncRNA steroid receptor RNA activator，lncRNA SRA）上調可促進小鼠顆粒細胞增殖，抑制顆粒細胞凋亡，促進雌二醇和孕酮的分泌[14]。circRNA表皮生長因子受體（circRNA epidermal growth factor receptor，circEGFR）的過表達可增加小鼠雌二醇合成和顆粒細胞生長，circEGFR的缺失則促進了孕酮產生并抑制顆粒細胞分泌雌二醇[15]。

3 ncRNA與卵巢衰老

始基卵泡池大小及卵泡消耗速度決定了生殖壽命的長短。卵巢衰老主要表現(xiàn)為卵泡數(shù)量減少和卵母細胞質量下降，發(fā)生機制尚不明確。任何影響卵泡池大小、加速卵泡閉鎖的因素都會影響女性的卵巢儲備功能。卵巢內的miRNA、lncRNA和circRNA等非編碼RNA可通過影響卵泡發(fā)育與閉鎖、卵巢局部激素的合成與分泌等參與和調控卵巢衰老的發(fā)生。

3.1 ncRNA和卵泡發(fā)育與閉鎖卵巢衰老的主要表現(xiàn)之一是卵巢內卵泡數(shù)目減少，可能由卵泡發(fā)育障礙與閉鎖加速導致。ncRNA參與調控卵泡發(fā)育和卵泡退化加速。選擇性敲除小鼠顆粒細胞中核糖核酸酶Dicer1后，成熟的miRNA無法形成，卵泡發(fā)育相關的抗苗勒管激素（Amh）、抑制素βA亞基（Inhba）、細胞色素P450c17α（Cyp17a1）、Cyp19a1、Gdf9、Bmp15等基因呈差異性表達，多種因素導致始基卵泡池消耗增加，早期卵泡募集[16]。miR-17-92簇是卵母細胞形成的重要調控因子，雌性小鼠生殖細胞中miR-17-92簇的缺失會使卵母細胞退化和卵泡閉鎖增加[17]。miR-106a下調作用于凋亡信號調節(jié)激酶1基因（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1），可降低人卵巢顆粒細胞發(fā)育能力，引起顆粒細胞凋亡[18]。

POF是一種病理性卵巢衰老，是指年齡不到40歲的女性，出現(xiàn)持續(xù)閉經至少6個月，血清FSH水平＞40 IU/L，還伴有一系列低雌激素癥狀。在POF患者的血漿和卵巢顆粒細胞中miR-23a和miR-27a呈高表達，miR-23a和miR-27a可靶向作用于SMAD5并通過凋亡相關因子配體-凋亡相關因子（FasL-Fas）通路調控人顆粒細胞凋亡和卵泡閉鎖[19-20]。多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是卵巢內分泌疾病的另一種狀態(tài)，雙側卵巢有較多的小卵泡，呈多囊樣改變。與POF患者不同，PCOS卵巢顆粒細胞中miR-23a表達水平明顯低于卵巢儲備正常女性；miR-27a-3p可通過靶向環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白（cyclic AMP response element-binding protein 1，Creb1）抑制CYP19A1表達，促進顆粒細胞凋亡，抑制雌二醇的產生，參與PCOS的發(fā)生[21-22]。

多種miRNA通過調節(jié)下游信號傳導參與了POF的發(fā)病。miR-181a在POF患者血液中顯著上調，動物實驗證明miR-181a通過下調激活素ⅡA型受體（activin receptor ⅡA，acvr2a）的表達來抑制激活素誘導的顆粒細胞增殖，在POF的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[23]。Chen等[24]的研究表明POF患者血漿及卵巢顆粒細胞中高表達的miR-146a通過caspase級聯(lián)途徑下調白細胞介素1受體相關激酶（interleukin-1 receptor-associated kinase，IRAK1）和腫瘤壞死因子受體相關因子6 （tumor necrosis factor receptorassociated factor 6，TRAF6）促進顆粒細胞凋亡。

信號傳導及轉錄激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）參與調控卵泡生長，應用小鼠POF模型研究發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p可通過靶向于STAT3的3′未翻譯區(qū)促進顆粒細胞凋亡[25]。在豬卵泡閉鎖過程中結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）降低，同時miR-10a-5p上調，體外實驗證明miR-10a-5p通過靶向與CTGF促進顆粒細胞凋亡，circINHA通過與miR-10a-5p競爭CTGF，可促進顆粒細胞增殖[26]。環(huán)磷酰胺可誘導小鼠卵巢萎縮，其機制是環(huán)磷酰胺通過激活lncRNAMeg3-p53-p66Shc，抑制小鼠顆粒細胞增殖，導致POF發(fā)生[27]。Zhao等[28]的研究顯示在人卵巢組織和血清中l(wèi)ncRNA HOX轉錄反義RNA（lncRNA HOTAIR）的過表達可以上調Notch-1減少卵巢細胞凋亡從而改善POF。另有研究發(fā)現(xiàn)，與卵巢儲備正常女性相比，生化性POI（biochemical POI，bPOI）患者顆粒細胞中存在133 個上調和424 個下調的circRNA，hsa_circ_003785、hsa_circ_103903和hsa_circ_008389有望作為bPOI的標志物，生物信息學研究結果顯示差異性表達的基因富集在叉頭轉錄因子（FOXO）信號通路，此通路參與顆粒細胞凋亡導致POI的發(fā)生[29]。

3.2 ncRNA與卵母細胞質量卵母細胞質量下降與DNA損傷修復失調、氧化應激和線粒體功能障礙等有密切關系，ncRNA在其中發(fā)揮了重要作用。

3.2.1 ncRNA與DNA損傷修復 共濟失調毛細血管擴張突變基因（ataxia-telangiectasia mutated，ATM）介導的DNA雙鏈斷裂修復途徑在維持DNA完整性方面發(fā)揮著重要作用，其表達隨衰老而顯著減少，損傷的卵母細胞DNA因修復減少會影響卵母細胞質量。核糖核酸酶ⅢDrosha是參與miRNA加工和成熟的酶，其缺失會影響同源重組（homologous recombination，HR） 和非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ），減少DNA修復。Dang等[30]發(fā)現(xiàn)miR-379-5p在POI患者顆粒細胞中表達增加，miR-379-5p通過抑制DNA損傷修復基因PARP1和XRCC6的表達，抑制顆粒細胞增殖，損傷DNA修復功能，導致POI的發(fā)生。最近的一項研究發(fā)現(xiàn)POI患者顆粒細胞中l(wèi)ncRNA HCP5下調，lncRNA HCP5與Y-盒結合蛋白1（Y-box binding protein 1，YB1）結合調控錯配修復基因MSH5（MutS Homolog-5）轉錄，破壞DNA損傷修復，導致顆粒細胞功能失調[31]。

3.2.2 ncRNA與氧化應激（oxidative stress） 活性氧（reactive oxygen species，ROS）是線粒體能量代謝的產物，能引起細胞損傷和衰老，人體中的抗氧化酶能及時清除ROS使機體維持穩(wěn)態(tài)。然而隨年齡增長，人體抗氧化酶的量和活性均降低，清除ROS能力下降，ROS在卵母細胞內累積會導致紡錘體不穩(wěn)定、染色體異常和端?？s短，影響卵母細胞的發(fā)育能力。Wang等[32]通過卵巢單細胞轉錄組譜發(fā)現(xiàn)在人顆粒細胞中抗氧化基因表達與年齡呈負相關，敲除抗氧化基因IDH1或NDUFDB10會引起氧化損傷。氧化應激是ROS在體內過量產生的一種現(xiàn)象，通過轉錄組測序技術（RNA-seq）分析顯示，氧化應激使豬顆粒細胞中2 025個基因呈差異性表達，其中包括1 940種mRNA和55種miRNA，ssc-miR-424和ssc-miR-27b等在FOXO、轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、Wnt（Wingless/Int）、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號通路中豐富表達，可以調節(jié)細胞凋亡、細胞增殖、應激反應和激素分泌等過程[33]。沉默信息調節(jié)因子2相關酶1（sirtuin1，SIRT1）是一種氧化應激防御蛋白，可作為miR-93的調控靶點，通過消耗ROS維持細胞存活，miR-93上調可抑制SIRT1表達，導致氧化防御減少致使卵母細胞老化[34]。miR-93同樣在PCOS患者顆粒細胞中高表達，通過靶向細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）影響顆粒細胞增殖導致卵泡發(fā)育紊亂[35]。

3.2.3 ncRNA與線粒體功能障礙 卵母細胞線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）拷貝數(shù)減少、突變率增加，引起電子傳遞鏈缺陷、能量代謝紊亂和膜電位改變，導致線粒體功能失調，卵母細胞質量下降。核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是一種調控抗氧化基因表達的轉錄因子，牛卵巢顆粒細胞中miR-28、miR-153和miR-708的過表達會引起Nrf2的下調，造成ROS累積，損傷線粒體功能，減少顆粒細胞增殖[36]。miR-181a在過氧化氫處理的顆粒細胞和3-硝基丙酸誘導的卵巢氧化應激模型中上調，miR-181a 上調使SIRT1下調引起FOXO1乙?；?，F(xiàn)OXO1在氧化應激下通過加強凋亡相關因子配體（FasL）和促凋亡蛋白Bim（Bcl-2 interacting mediator of cell death）的表達引發(fā)顆粒細胞凋亡，并通過提高B細胞淋巴瘤/白血病-2基因相關蛋白X（Bcl-2 associated X protein，Bax） 與B 細 胞 淋 巴 瘤/白 血 病-2 基 因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的比例，激活凋亡效應蛋白Caspase-3，加速線粒體凋亡通路[37]。

3.3 ncRNA和激素合成與分泌卵巢衰老會引起內分泌失衡，出現(xiàn)月經改變、潮熱出汗、激動易怒和性功能減退等圍絕經癥狀，心血管疾病和骨質疏松等疾病的發(fā)生率顯著增加。ncRNA通過調控卵巢相關激素的合成和分泌，參與卵巢衰老過程。

漢族POF患者血漿中miR-22-3p下調會引起FSH上升，動物實驗也證實豬垂體前葉中可檢測到miR-22-3p，用促性腺激素釋放激素（gonadotropin releasing hormone，GnRH）處理豬下丘腦后，miR-22-3p明顯下調，提示其可能參與垂體對FSH分泌的特異性調控[38]。使用miRNA-21-3p和miRNA-433抑制劑處理小鼠腺垂體前葉細胞后，可上調FSH β亞單位表達水平，導致FSH分泌增加[39]。隨年齡增長，類固醇激素合成相關的基因下調，circRNA 103827和circRNA 104816在高齡女性顆粒細胞中上調，通過參與葡萄糖代謝和有絲分裂周期調控類固醇激素生成與卵泡微環(huán)境的惡化[40]。circDDX10-miR-1301-3p/miR-4660-SIRT3相互作用參與了卵巢衰老過程，circDDX10可能通過影響類固醇激素合成，參與卵巢衰老的調控[41]。

4 結語與展望

近年卵巢衰老引起的生育力下降引起廣泛關注，POF和POI等病理性卵巢衰老嚴重危害女性生殖健康，針對卵巢衰老發(fā)生機制的研究，闡明各因素間的相互作用，是早發(fā)現(xiàn)、早治療和改善女性生殖健康的關鍵，對提高女性生殖健康有重要的科學意義。研究發(fā)現(xiàn)，ncRNA在調控卵巢功能中發(fā)揮重要作用，通過調節(jié)卵泡發(fā)育與閉鎖、卵巢局部激素的合成與分泌等過程參與卵巢衰老的發(fā)生，影響卵泡數(shù)量和卵母細胞質量。目前卵巢衰老的發(fā)生機制尚不明確，ncRNA在卵巢衰老中的調節(jié)機制有待進一步研究。隨著科學技術的不斷進步，有越來越多ncRNA及靶基因被發(fā)現(xiàn)，ncRNA將可能成為評估卵巢儲備功能的新指標，其類似物或抑制劑將有可能用于調節(jié)卵巢衰老信號通路、干預生殖衰老過程。ncRNA在未來將揭示更多卵巢生理和病理調控機制，為卵巢衰老及其他卵巢功能障礙的發(fā)生和治療提供新的視角。