唐少雄 呂友慧 宋 凱 楊利學(xué)

(1 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院， 咸陽市 712000，電子郵箱:tangsx3@163.com;2 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院脊柱骨科，咸陽市 712000)

【提要】 目前實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)中醫(yī)藥防治椎間盤突出有確切療效。運(yùn)用含中藥動物血清進(jìn)行體外干預(yù)退變椎間盤細(xì)胞有效、可行，不僅克服倫理問題，還能夠反映藥物在體內(nèi)真實(shí)狀態(tài)，有助于深入探究中醫(yī)藥在防治椎間盤退變的作用機(jī)制。本文就含中藥動物血清干預(yù)動物及人椎間盤細(xì)胞的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

椎間盤退變是引起頸部或腰背部疼痛的一種常見病因，影響人類健康及生活水平，嚴(yán)重時可造成高致殘率和巨大的醫(yī)療成本。隨著中國社會經(jīng)濟(jì)、醫(yī)療水平的不斷提升，高齡老人越來越多，退變性椎間盤相關(guān)腰腿痛的發(fā)病率也越來越高[1-2]。中醫(yī)藥防治椎間盤退變的效果受到關(guān)注，并且獲得大量動物實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。然而，其作用機(jī)制仍未完全清楚，且動物實(shí)驗(yàn)研究的作用機(jī)制是否等同于臨床作用機(jī)制，仍需在人體椎間盤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步去證實(shí)。

含中藥血清是指給動物服用一定量的藥物，經(jīng)過一段時間后采集血液，離心后所得到的血清[3-4]。利用含中藥血清進(jìn)行體外干預(yù)，可較為接近真實(shí)藥物在體內(nèi)產(chǎn)生藥效的真實(shí)過程：藥物原有成分在體內(nèi)或轉(zhuǎn)化為活性成分，或代謝后失活，或沒有被吸收入體內(nèi)，或通過第二信使間接發(fā)揮作用。這使得體外實(shí)驗(yàn)?zāi)M了體內(nèi)過程，達(dá)到了體外實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚍从乘幬矬w內(nèi)真實(shí)狀態(tài)的目的[5-6]；克服了中藥粗制劑直接加入反應(yīng)體系中進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)，能從一定程度上反映中藥方劑復(fù)雜體系與生物機(jī)體的復(fù)雜生命系統(tǒng)的相互作用的規(guī)律。相比于直接以中藥復(fù)方制劑干預(yù)的體外實(shí)驗(yàn)，制備含中藥血清進(jìn)行的體外研究，其結(jié)果更具科學(xué)和可信度[7-8]。本文就含中藥動物血清干預(yù)退變椎間盤細(xì)胞的研究進(jìn)展做一綜述。

1 椎間盤退變機(jī)制

椎間盤是相鄰兩個椎體間獨(dú)特的組織，其包含外層和中央部，前者為富含彈性的Ⅰ型膠原蛋白纖維環(huán)，后者為富含Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖的髓核和軟骨終板[9]。椎間盤的退變與椎間盤細(xì)胞膠原蛋白合成減少、椎間盤蛋白聚糖降解增強(qiáng)、髓核細(xì)胞的減少均有著密切的關(guān)系[10-12]。在椎間盤退變各結(jié)構(gòu)破壞改變中，最突出的是環(huán)撕裂、椎間盤脫出、終板損傷、椎管狹窄和椎骨內(nèi)骨贅形成。單次沖擊、周期性和連續(xù)載荷、彎曲、軸向旋轉(zhuǎn)以及復(fù)雜的載荷機(jī)制等均影響椎間盤結(jié)構(gòu)。但是，長期負(fù)重對脊椎的破壞更大，嚴(yán)重的后果包括代謝酶和生長因子的失衡、椎間盤應(yīng)力分布的改變以及機(jī)械剛度的降低，從而導(dǎo)致脊柱生物力學(xué)受損。這一點(diǎn)也得到Vergroesen等[13]的研究結(jié)果的支持，其認(rèn)為力學(xué)和生物學(xué)都是椎間盤退變的主要原因，且兩者相互聯(lián)系、相互放大。這種觀點(diǎn)也得到了越來越多的認(rèn)可，即細(xì)胞生理受到機(jī)械負(fù)荷的強(qiáng)烈影響。Vergroesen等[13]同時提出，機(jī)械過載會導(dǎo)致分解代謝細(xì)胞反應(yīng)和水結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)變性的惡性循環(huán)。這不僅說明了椎間盤退變的復(fù)雜性，也解決了該領(lǐng)域的一些爭議，因?yàn)樽甸g盤的退變可以在任何時候進(jìn)入惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致相同的病理。

2 椎間盤退變的特征以及含中藥動物血清體外干預(yù)動物退變椎間盤細(xì)胞

相關(guān)學(xué)者通過動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ湍M人椎間盤退變過程，間接觀察人椎間盤退變特征。例如，Choi等[14]建立的SM/J模型小鼠品系概括了人類椎間盤退變的許多顯著特征，其退化過程的特征包括：(1)髓核細(xì)胞減少，椎間盤蛋白聚糖基質(zhì)穩(wěn)態(tài)發(fā)生紊亂，而椎間盤蛋白聚糖基質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡和損失更加速了椎間盤細(xì)胞衰老。無論是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還是體外實(shí)驗(yàn)，椎間盤蛋白聚糖的快速喪失都能加速椎間盤細(xì)胞衰老[2]。(2)髓核與纖維環(huán)或終板軟骨之間的區(qū)別消失。(3)髓核和纖維環(huán)表現(xiàn)出較高的組織學(xué)等級。(4)聚集蛋白聚糖的作用顯著。(4)髓核中膠原蛋白X和基質(zhì)金屬蛋白酶13的異常表達(dá)，以及軟骨細(xì)胞肥大的標(biāo)志物Ⅹ型膠原蛋白α1、結(jié)締組織生長因子和Runx2的表達(dá)升高。(6)髓核細(xì)胞促進(jìn)營養(yǎng)不良礦化。(7)椎間盤變硬，高度降低，椎骨質(zhì)量變差。

研究表明，對動物退變椎間盤細(xì)胞進(jìn)行含中藥血清體外干預(yù)是可行的，可直觀地了解到經(jīng)過含中藥血清干預(yù)后椎間盤細(xì)胞形態(tài)學(xué)、病理學(xué)方面的改變[15-17]。牛凱等[18]運(yùn)用含桃仁-紅花血清干預(yù)白細(xì)胞介素(interleukin)-1β誘導(dǎo)的大鼠退變椎間盤細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含中藥血清可抑制大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)軟骨終板細(xì)胞的增殖，上調(diào)軟骨蛋白聚糖、Ⅱ型膠原蛋白α1和SOX9 mRNA表達(dá)，下調(diào)Ⅹ型膠原蛋白α1和IL-6 mRNA的表達(dá)。徐無忌等[19-20]、吳國華等[21]應(yīng)用含六味地黃丸血清對兔椎間盤體外退變模型細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)， 發(fā)現(xiàn)其可以延緩?fù)米甸g盤體外退變模型細(xì)胞外基質(zhì)中糖胺多糖、硫酸軟骨素/硫酸角質(zhì)素比值、透明質(zhì)酸含量的降低程度，上調(diào)髓核細(xì)胞JNK及P38通路的mRNA含量及蛋白表達(dá)量，從而在一定程度上可以延緩椎間盤細(xì)胞的退變；同時其可降低椎間盤膠原蛋白總體含量下降速率，改善椎間盤內(nèi)環(huán)境，從而減慢椎間盤退變進(jìn)程，達(dá)到保護(hù)椎間盤的作用。以上研究表明，含中藥血清可通過抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)相關(guān)成骨因子或軟骨相關(guān)因子、細(xì)胞外基質(zhì)成分等途徑，延緩椎間盤細(xì)胞的退變。這為含中藥血清干預(yù)人體退變椎間盤細(xì)胞奠定了一定的基礎(chǔ)。

3 含中藥動物血清干預(yù)人退變椎間盤細(xì)胞

3.1 含中藥動物血清干預(yù)人退變椎間盤細(xì)胞的可行性 應(yīng)用含中藥動物血清干預(yù)人體細(xì)胞組織的體外實(shí)驗(yàn)研究，可以有效地解決直接在人體實(shí)驗(yàn)的倫理問題，并且可以在體外直觀觀察并檢測各類干預(yù)性指標(biāo)。 有學(xué)者采用大鼠或家兔制備含中藥血清，成功干預(yù)人體腎小管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、單核細(xì)胞、軟骨細(xì)胞[22-26]。應(yīng)用動物含中藥血清成功干預(yù)人體不同組織細(xì)胞，為含中藥動物血清體外干預(yù)人體其他細(xì)胞開辟了新途徑，也為探索中醫(yī)藥治療疾病的現(xiàn)代機(jī)制打下了堅實(shí)的基礎(chǔ)。

3.2 含中藥動物血清干預(yù)人退變椎間盤細(xì)胞 隨著研究的深入，提取含中藥動物血清干預(yù)人體椎間盤組織也有了突破[27]。周紅海等[28]給大鼠灌胃益氣活血方后提取其含中藥血清作為藥源，對體外培養(yǎng)的人退變椎間盤髓核細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，益氣活血方血清可上調(diào)非破裂型腰椎間盤突出退變髓核細(xì)胞中聚蛋白多糖 mRNA的表達(dá)，促進(jìn)ColⅡ的合成，恢復(fù)椎間盤的剛性支撐框架，并可促進(jìn)蛋白多糖的合成，增加與水的結(jié)合，對抗壓力，分散和吸收負(fù)荷，從而改善非破裂型突出腰椎間盤的組織結(jié)構(gòu)和力學(xué)特性。陳江等[29]給新西蘭兔灌胃身痛逐瘀湯后提取含中藥血清作為藥源，發(fā)現(xiàn)身痛逐瘀湯血清對人退變髓核細(xì)胞活力、形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用，推測其可能通過上調(diào)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路的表達(dá)延緩人髓核細(xì)胞凋亡，從而延緩椎間盤退變。周文明等[30]給大鼠灌胃補(bǔ)腎壯督方后提取含中藥血清作為藥源，對人髓核細(xì)胞退變模型進(jìn)行體外干預(yù)，結(jié)果顯示，補(bǔ)腎壯督方血清可有效抑制髓核細(xì)胞凋亡，其可能通過減少B細(xì)胞淋巴瘤2相關(guān)X蛋白、凋亡酶激活因子1、細(xì)胞色素C的蛋白及mRNA表達(dá)，增加B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白表達(dá)，從而減少線粒體信號通路所導(dǎo)致的髓核細(xì)胞凋亡，改善椎間盤退變。以上實(shí)驗(yàn)研究表明，中藥復(fù)方在人體內(nèi)可能通過抑制椎間盤細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)相關(guān)膠原蛋白及基因的表達(dá)、改善椎間盤微結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到延緩椎間盤退變。

4 小 結(jié)

應(yīng)用含中藥動物血清進(jìn)行中藥藥效作用的觀察、研究，能更好地反映藥物在體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生藥效的真實(shí)過程，在理論上更具有科學(xué)性與真實(shí)性，有利于從細(xì)胞分子水平上探討中藥的作用機(jī)理。含中藥動物血清替代人血清體外干預(yù)人體細(xì)胞的成功，轉(zhuǎn)換了以往完全脫離人體的動物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)而可以在體外直觀地觀察人體細(xì)胞在中藥干預(yù)下的變化過程，使實(shí)驗(yàn)研究更加貼近藥物在人體的藥效反應(yīng)過程，運(yùn)用含中藥動物血清干預(yù)人退變椎間盤細(xì)胞，克服了不能直接提取口服中藥后的人體血清及人退變椎間盤組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的倫理學(xué)問題，觀察到的結(jié)果更接近中藥在人體中的作用結(jié)果。因此，運(yùn)用含中藥動物血清進(jìn)行體外干預(yù)退變椎間盤細(xì)胞是有效、可行的，可更加深入地探究中醫(yī)藥在防治椎間盤退變過程中的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥臨床治療腰椎間盤突出癥提供科學(xué)依據(jù)。而諸多的含中藥動物血清體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明，含中藥血清可有效改善、延緩椎間盤細(xì)胞退變。其可能通過抑制椎間盤細(xì)胞的凋亡、抑制椎間盤膠原蛋白含量下降、增加椎間盤膠原蛋白的表達(dá)、保護(hù)椎間盤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、維持椎間盤蛋白聚糖基質(zhì)穩(wěn)態(tài)等方面防治椎間盤退變。