梅瑾 王昊 王敏 何茶英

染色體異常是導致自然流產(chǎn)和嬰兒出生缺陷的常見因素[1]。既往對流產(chǎn)物開展遺傳學檢測方法有限，主要是通過絨毛細胞培養(yǎng)法[2-3]檢測胚胎組織染色體異常，但該方法操作過程繁瑣，細胞培養(yǎng)周期長，容易發(fā)生母體細胞污染。此外臨床上還常用染色體微陣列芯片[4]、微陣列比較基因組雜交技術(shù)[5]等對流產(chǎn)物進行檢測，但費用較高，患者接受度較差。近年來二代測序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域得到普遍應用，通過對流產(chǎn)物樣本進行低深度全基因組測序，可以獲取準確的基因組變化信息，在相對較低成本下得到高分辨率、高準確率的基因組異常信息，逐漸成為流產(chǎn)物遺傳學診斷的常用技術(shù)[6-7]。目前臨床上采用NGS對流產(chǎn)物染色體拷貝數(shù)改變進行分析的大樣本研究報道不多，本研究選取2015年9月至2018年6月不明原因流產(chǎn)和死胎的孕婦639例，采用NGS對其絨毛或胎兒樣本進行全基因組測序，并完成染色體拷貝數(shù)改變分析，探討NGS在流產(chǎn)物染色體拷貝數(shù)改變檢測中的應用價值。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2015年9月至2018年6月在本院門診的不明原因流產(chǎn)和死胎的孕婦639例，年齡22～44（29.1±5.6）歲，孕周 7～26（12.8±5.8）周。所有孕婦均經(jīng) B超診斷為胚胎停育、死胎。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過。

1.2 樣本采集 所有孕婦均在知情同意的原則下，按婦產(chǎn)科常規(guī)施行手術(shù)操作，孕7～14周者行人工流產(chǎn)術(shù)，采集無母血污染的清潔胚胎絨毛組織約5～10g；孕15～26周死胎者行引產(chǎn)術(shù)，留取清潔的死胎皮膚肌肉標本約5～10g；均放入專用試管內(nèi)冷凍保存。次日冷鏈快遞運輸至湖南家輝遺傳?？漆t(yī)院實驗室檢測。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 選取冷凍的流產(chǎn)組織10mg，采用DNA試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取基因組DNA，按照試劑盒說明書操作。采用NanoDrop 2000分光光度計（美國Thermo Fisher公司）檢測DNA純度和濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。

1.3.2 DNA文庫構(gòu)建與測序 提取的基因組DNA經(jīng)超聲儀打斷成小片段核酸，然后以小片段核酸為起始模板，構(gòu)建文庫。將小片段DNA 5′端和3′端作平末端化處理；采用T4-DNA連接酶（美國Enzymatics公司），連接接頭序列在DNA片段兩端；進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段；采用聚合酶鏈反應（PCR）法進行DNA擴增，磁珠法進行DNA片段純化，去除二聚體干擾，構(gòu)建好的測序文庫經(jīng)實時熒光定量PCR法檢測合格后，進行上機測序；使用美國Illumina HiSeq 2500測序平臺，對樣本進行全基因組測序；測序結(jié)果進行染色體拷貝數(shù)改變分析[8]。

1.3.3 染色體拷貝數(shù)改變分析 通過生物信息學軟件分析NGS測序結(jié)果，將每個測序的Read標簽匹配到對應的染色體上，然后進行Z值標準化分析，根據(jù)Z值進行染色體異常的判定。本研究中通過檢索公共數(shù)據(jù)庫，如 Decipher數(shù)據(jù)庫（https://decipher.sanger.ac.uk/syndromes）、Database of Genomic Variants數(shù)據(jù)庫(http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home)和 Orphanet數(shù)據(jù)庫（http://www.orpha.net/consor/cgi-bin/index.php?lng=EN），分析測序結(jié)果中染色體拷貝數(shù)改變的臨床意義。

1.3.4 染色體拷貝數(shù)改變致病性判讀 根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學會的指南[6]，判讀原則為：拷貝數(shù)是重復或缺失、是否涉及已知的單倍劑量不足基因、片段上含有的基因數(shù)量、相關(guān)病例文獻及數(shù)據(jù)庫查詢結(jié)果以及雙親是否攜帶的情況進行評分，根據(jù)評分結(jié)果從大到小將染色體拷貝數(shù)改變分 5類，致病（≥0.99分）、可能致?。?.90～0.98分）、臨床意義不明確（-0.89～0.89分）、可能良性（-0.90～-0.98分）、良性（≤-0.99分）。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 染色體拷貝數(shù)改變檢出情況 639例孕婦中，因DNA降解導致檢測失敗9例，完成NGS檢測630例。630例患者中，≥35歲78例，＜35歲552例；NGS檢測結(jié)果為陰性315例，整條染色體改變和（或）拷貝數(shù)改變315例，檢出率為50.00%。315例異常中，250例涉及整條染色體增減或改變，包括單體64例（10.16%），三體169例（26.83%），三倍體1例（0.16%），復合三體 9例（1.43%），性染色體單體和（或）三體嵌合體7例（1.11%），見表1；65例為染色體片段的拷貝數(shù)改變，拷貝數(shù)減少的片段大小范圍為1.06～85.24Mb，拷貝數(shù)增加的片段大小范圍為 1.42～135.80Mb，其中明確致病性 30例（4.76%），可能致病性5例（0.79%），見表2，臨床意義不明確的23例（3.65%），可能良性4例（0.63%），良性 3例（0.48%）。

2.2 不同年齡組孕婦整條染色體增減或改變檢出情況≥35歲組孕婦整條染色體增減或改變檢出率為44.87%（35/78）；＜35歲組孕婦整條染色體增減或改變檢出率為38.95%（215/552）；兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.000，P=0.316）。

2.3 不同年齡組孕婦致病性染色體片段拷貝數(shù)改變檢出情況 ≥35歲組孕婦致病性染色體片段拷貝數(shù)異常檢出率為5.13%（4/78）；＜35歲組孕婦致病性染色體片段拷貝數(shù)異常檢出率為5.62%（31/552）；兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.031，P=0.860）。

3 討論

引起自然流產(chǎn)的原因包括遺傳因素、環(huán)境因素等，其中胚胎的染色體拷貝數(shù)改變是最主要的遺傳因素，有研究顯示約50%的流產(chǎn)物存在染色體異常，其中包括整條染色體改變和結(jié)構(gòu)異常[9-10]。本研究應用NGS對630例絨毛或胎兒組織DNA進行低深度全基因組測序，并進行染色體拷貝數(shù)改變分析，結(jié)果顯示染色體拷貝數(shù)改變315例，檢出率為50.00%。其中整條染色體增減或改變占大多數(shù)，具體為單體64例、三體169例，檢出率分別為10.16%和26.83%，該數(shù)據(jù)與之前的研究結(jié)果一致[11]。本次檢測另發(fā)現(xiàn)7例46,XY/46,XX嵌合，不排除為標本母源污染所致。

表1 整條染色體增減或改變檢出情況

表2 致病性染色體片段拷貝數(shù)改變檢出情況

除整條染色體增減或改變外，本研究還檢出染色體拷貝數(shù)改變65例，檢出率為10.32%，高于之前的研究報道[12]。經(jīng)查詢Decipher數(shù)據(jù)庫、Database of Genomic Variants數(shù)據(jù)庫和Orphanet數(shù)據(jù)庫，明確致病30例，可能致病5例，臨床意義不明確23例，可能良性4例，良性3例，其中明確致病的拷貝數(shù)改變檢出率為4.76%，與van den Berg等[13]報道一致。致病性染色體片段拷貝數(shù)改變（染色體微缺失微重復）可引起臨床表現(xiàn)復雜的遺傳性綜合征[14]，其表現(xiàn)為嚴重精神發(fā)育遲滯、智力低下、多器官畸形、癲癇、肌張力減退等。其形成因素有非等位同源重組以及非同源末端連接等[15]。近年來不斷有報道提出，染色體拷貝數(shù)改變還與早期流產(chǎn)的發(fā)生密切相關(guān)。張影等[16]通過NGS對252例復發(fā)性流產(chǎn)患者的流產(chǎn)絨毛組織進行分析，結(jié)果共檢出124例（49.21%）發(fā)生染色體異常，其中101例為整條染色體改變，23例為染色體拷貝數(shù)改變，通過數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，檢出的染色體片段拷貝數(shù)改變多數(shù)與早期流產(chǎn)、胚胎停育相關(guān)。陳俊坤等[17]采用NGS檢測了140例早期流產(chǎn)患者的流產(chǎn)物組織，發(fā)現(xiàn)82例（58.57%）的染色體異常，其中67例為整條染色體改變，15例為染色體拷貝數(shù)改變。以上研究和本文結(jié)果均表明染色體拷貝數(shù)改變是引起自然流產(chǎn)的原因之一。本研究中檢出的臨床意義不明片段拷貝數(shù)改變，可能需要根據(jù)數(shù)據(jù)庫的更新作進一步分析，即現(xiàn)在的臨床意義不明病例可能會重新分類成致病性或良性。

本研究還發(fā)現(xiàn)，≥35歲孕婦和＜35歲孕婦整條染色體增減或改變檢出率分別為44.87%和38.95%，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義，與以往的研究報道不一致[2]。分析其原因：≥35歲孕婦檢測樣本量少，僅78例，不能反映該組群體的發(fā)生率；而＜35歲孕婦檢測樣本量多，而且針對的是自然流產(chǎn)和死胎患者的染色體拷貝數(shù)檢出率，陽性率高，不能代表低齡普通群體的檢出率，兩者比較不能真正反映統(tǒng)計學差異。依據(jù)染色體拷貝數(shù)變異的發(fā)病機制，其遺傳變異與母親年齡無關(guān)，故在不同年齡群體中發(fā)病率一致，本研究中≥35歲孕婦和＜35歲孕婦染色體致病性片段拷貝數(shù)改變檢出率分別為5.13%和5.62%，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義，也可說明這一點。

目前，傳統(tǒng)的染色體核型分析技術(shù)仍然是臨床上檢測整條染色體改變和大片段的結(jié)構(gòu)異常的金標準，但該方法存在操作過程繁瑣、細胞培養(yǎng)周期長、母體細胞容易污染，培養(yǎng)失敗等缺點。高通量測序技術(shù)具有檢測周期短、便捷高效等優(yōu)點?；贜GS對整條染色體改變和拷貝數(shù)改變進行分析，能夠在相對較短的時間內(nèi)發(fā)現(xiàn)患者除染色體平衡易位以外的患者染色體片段的異常，可以作為一種有效的遺傳學診斷方法在臨床應用。