譚艷林 張強(qiáng) 劉秀飄 熊博凱 楊佩佩 楊羽晨

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科330006

0 引言

常見外傷、腫瘤、先天畸形等疾病常易導(dǎo)致頜骨缺損，如何有效重建頜骨缺損及恢復(fù)患者的口頜系統(tǒng)功能是口腔頜面外科醫(yī)生面對(duì)的主要挑戰(zhàn)之一。機(jī)體具有自身修復(fù)功能，可修復(fù)范圍較小的頜骨缺損，但對(duì)于范圍較大的復(fù)雜頜骨缺損，則很難完成缺損區(qū)的骨修復(fù)重建[1]。此時(shí)，有賴于一些特殊的治療手段，包括牽張成骨術(shù)、自體骨移植、骨替代生物材料等。目前常見的骨修復(fù)重建手段均有較為明顯的缺點(diǎn)，例如牽張成骨術(shù)較適合長骨類型的修復(fù)，對(duì)于形態(tài)復(fù)雜的骨缺損修復(fù)效果較差，且修復(fù)過程復(fù)雜而周期長[2]；自體骨移植作為骨缺損修復(fù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，存在手術(shù)創(chuàng)口較多及骨來源部位受限等弊端[3]。

近年來，隨著材料學(xué)及骨組織工程學(xué)的快速發(fā)展，具有優(yōu)良性能的骨替代材料已廣泛應(yīng)用于臨床[4]。Urist[5]在1965年首先發(fā)現(xiàn)了材料的骨誘導(dǎo)現(xiàn)象，成為骨誘導(dǎo)研究領(lǐng)域的里程碑。骨誘導(dǎo)性是指生物材料植入體內(nèi)后誘導(dǎo)組織間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞并最終形成骨組織的能力[6]。之后諸多學(xué)者通過不同材料在不同動(dòng)物體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了材料表面微結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)成骨的現(xiàn)象。包崇云和張興棟[7-8]在此基礎(chǔ)上提出了“體內(nèi)組織工程學(xué)”概念，克服了種子細(xì)胞不穩(wěn)定的缺陷，由此骨誘導(dǎo)性材料的研究成為熱點(diǎn)。目前多數(shù)研究集中于材料表面微結(jié)構(gòu)對(duì)成骨細(xì)胞的作用方面，而破骨細(xì)胞在骨代謝和骨重建過程中具有重要作用，關(guān)于材料微結(jié)構(gòu)對(duì)破骨細(xì)胞的作用及調(diào)控方面報(bào)道很少。本文就材料表面微結(jié)構(gòu)對(duì)破骨細(xì)胞的影響進(jìn)行綜述。

1 破骨細(xì)胞在骨組織工程中的作用

骨組織工程的發(fā)展，其最終目的是基于骨生理，在材料植入部位重演骨修復(fù)的過程，達(dá)到具有天然骨結(jié)構(gòu)和功能的再生。目前骨組織工程已取得了很大進(jìn)步，種子細(xì)胞及新型支架材料的研發(fā)均推動(dòng)著骨組織工程的發(fā)展。但依然存在許多問題，最主要的問題是體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞與體內(nèi)成骨細(xì)胞存在著功能及形態(tài)差異，其形成的骨組織因結(jié)構(gòu)不良而不能應(yīng)用于臨床負(fù)重骨缺損的修復(fù)。研究結(jié)果表明，缺乏破骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，骨發(fā)育過程中的成骨細(xì)胞行為會(huì)出現(xiàn)異常，導(dǎo)致骨基質(zhì)排列紊亂及礦化缺陷。而大量研究結(jié)果也證實(shí)破骨細(xì)胞的缺失可導(dǎo)致體外骨形成異常[9-12]。因此，引入破骨細(xì)胞是解決目前骨組織工程中面臨問題的必不可少的途徑。

基于骨重塑的生理機(jī)制，破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的相互作用在骨重塑過程中至關(guān)重要，其主要通過細(xì)胞間直接接觸、分泌旁分泌因子間接調(diào)控以及骨基質(zhì)的橋梁作用這3種方式進(jìn)行相互調(diào)節(jié)。破骨細(xì)胞對(duì)成骨細(xì)胞的調(diào)控作用在骨組織工程中尤為重要，破骨細(xì)胞的形成是材料骨誘導(dǎo)的先決條件[13-14]，其通過表達(dá)和分泌信號(hào)分子（如甲狀旁腺激素、類胰島素生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白和β-轉(zhuǎn)化生長因子）影響成骨細(xì)胞行為并誘導(dǎo)成骨[15]。

此外，隨著再生醫(yī)學(xué)向精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的轉(zhuǎn)變，骨再生傾向于完全恢復(fù)原來的組織，這就要求骨移植替代物具有骨誘導(dǎo)性的同時(shí)，其自身可被吸收[9,16]，在一定時(shí)間內(nèi)被吸收并被新生骨組織替換，即骨重塑在植入部位的重演。而人工合成的骨移植替代物的降解主要依賴兩條途徑，即物理化學(xué)溶解和細(xì)胞介導(dǎo)的吸收作用。不同的材料其降解方式不同，降解速度也各異。例如人工合成磷酸三鈣（tricalcium phosphate，TCP）的化學(xué)降解作用比細(xì)胞介導(dǎo)的吸收作用更快，而天然骨移植替代物和羥基磷灰石（hydroxyapatite,HA）則主要依賴于破骨細(xì)胞的吸收機(jī)制[17-18]。破骨細(xì)胞是唯一能吸收骨組織和支架材料的細(xì)胞[19-20]。關(guān)于材料降解速度的差異化問題一直未得以解決，支架材料降解太快會(huì)過早喪失骨誘導(dǎo)性及骨傳導(dǎo)功能，不利于新骨形成；降解太慢則不利于骨重塑及骨完全再生。目前各種支架材料的最佳降解速率尚需進(jìn)一步研究。

由此可見，破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞一樣，在骨組織工程中的作用不容忽視。短期內(nèi)，破骨細(xì)胞的引入可維持支架孔隙度以利于移植后的血管神經(jīng)重建以及材料內(nèi)部營養(yǎng)供應(yīng)；而破骨細(xì)胞對(duì)成骨細(xì)胞的調(diào)控，對(duì)于類板層骨結(jié)構(gòu)的形成及臨床應(yīng)用推廣有著更深遠(yuǎn)的意義。目前，對(duì)于成骨細(xì)胞在骨組織工程中的應(yīng)用已進(jìn)行了廣泛研究，而破骨細(xì)胞的作用往往被忽略，尚需深入研究。

2 材料表面微結(jié)構(gòu)對(duì)破骨細(xì)胞的調(diào)控作用

破骨細(xì)胞對(duì)植入材料的吸收作用在再生醫(yī)學(xué)中至關(guān)重要，同時(shí)，材料的理化性質(zhì)亦會(huì)影響破骨細(xì)胞的行為。細(xì)胞與材料之間的反應(yīng)包含復(fù)雜的生物學(xué)相互作用，其受材料表面物理化學(xué)特性的影響，特別是表面物理微觀形貌，納米和微米級(jí)的粗糙度均可影響細(xì)胞黏附、增殖分化及相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[21]。在骨組織工程中，改變支架材料的表面物理微觀形貌，是提高植入物和支架材料生物學(xué)性能的直接而有效的途徑。

目前，材料微結(jié)構(gòu)在啟動(dòng)骨誘導(dǎo)性過程中的關(guān)鍵作用已被大多數(shù)研究者所接受[22-26]?；谄乒羌?xì)胞和成骨細(xì)胞在骨重塑中的耦合機(jī)制[9,27]，在材料微結(jié)構(gòu)對(duì)成骨細(xì)胞的調(diào)控研究基礎(chǔ)上，有少量文獻(xiàn)報(bào)道了材料微結(jié)構(gòu)對(duì)破骨細(xì)胞的影響，指出不同材料、不同微結(jié)構(gòu)（即尺寸范圍、幾何形狀和表面參數(shù)等）均會(huì)影響破骨細(xì)胞的行為[28-29]。體內(nèi)外研究結(jié)果顯示，材料表面物理參數(shù)（表面的微觀結(jié)構(gòu)和宏觀結(jié)構(gòu)）對(duì)于促進(jìn)植入部位破骨細(xì)胞的生成和觸發(fā)異位骨形成意義重大[30]。

2001年Webster等[31]首次研究了陶瓷表面納米/微觀結(jié)構(gòu)對(duì)破骨細(xì)胞功能的影響，發(fā)現(xiàn)除材料化學(xué)組成和溶解度外，表面納米/微米級(jí)結(jié)構(gòu)亦影響破骨細(xì)胞的生成，表明材料表面物理微觀形貌可調(diào)控破骨細(xì)胞行為。之后大量研究結(jié)果也證實(shí)在材料的化學(xué)成分、孔徑、孔隙率均相同時(shí)，材料表面微觀形貌影響著支架材料的可吸收性，其對(duì)破骨細(xì)胞生存及活化具有重要影響[32]。

在控制了材料化學(xué)成分、物理結(jié)構(gòu)（包括孔隙率、孔徑等）等可影響破骨細(xì)胞功能的其他因素后，材料表面微結(jié)構(gòu)對(duì)破骨細(xì)胞可產(chǎn)生重要影響。其中材料表面粗糙度可影響破骨細(xì)胞行為，包括破骨分化及破骨吸收功能等，但具體機(jī)制尚無明確定論。關(guān)于表面的“粗糙”或“光滑”尚無清晰定義，且究竟粗糙度在何范圍內(nèi)促進(jìn)破骨細(xì)胞行為，何范圍內(nèi)抑制破骨細(xì)胞行為，亦無明確界定。

Hayes等[21]分析粗糙的定義主要取決于細(xì)胞的尺寸大小，包括平均粗糙度和波峰間距；在粗糙度Ra＞2 μm時(shí)，若波峰間距大于等于成骨細(xì)胞大小，則成骨細(xì)胞表現(xiàn)為光滑平面上成纖維細(xì)胞樣形態(tài)；反之，則成骨細(xì)胞不能鋪展并表現(xiàn)為典型的成骨細(xì)胞形態(tài)。由于成骨細(xì)胞（細(xì)胞直徑平均為10 μm）與破骨細(xì)胞（細(xì)胞直徑可達(dá)20～100 μm）尺寸大小不一，故同一種結(jié)構(gòu)對(duì)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞可產(chǎn)生明顯不同的影響。Costa等[33]發(fā)現(xiàn)，微粗糙的HA3[Ra=363 nm（原子力顯微鏡）或 2 μm（輪廓測定法）]有利于成骨細(xì)胞的黏附，能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，但不利于黏著斑形成；而光滑的HA1[Ra=194 nm（原子力顯微鏡）或1 μm（輪廓測定法）]上破骨細(xì)胞黏附率是粗糙的HA3上黏附率的2.5倍，且破骨細(xì)胞吸收功能活性也較HA3強(qiáng)。

在Matsunaga等[34]的研究中，當(dāng)大鼠破骨細(xì)胞于不同粗糙度的骨片上培養(yǎng)時(shí)，在Ra=1.0 μm時(shí)骨片吸收率最大；在Ra=2.9 μm時(shí)，骨片吸收量減少約20%。Costa-Rodrigues等[35]在燒結(jié)的HA上培養(yǎng)人外周血單個(gè)核細(xì)胞，并采用核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）誘導(dǎo)破骨分化，發(fā)現(xiàn)在較粗糙的表面上形成了更多的破骨細(xì)胞，其Ra值均＜2μm（Ra在0.0437～0.582 0 μm）。Davison等[20]比較了TCPs（Ra=0.126 μm）與TCPb（Ra=1.287 μm）上RAW264.7細(xì)胞的破骨分化，發(fā)現(xiàn)TCPs表面上形成的破骨細(xì)胞數(shù)是TCPb的2 倍，且 TCPb未被吸收。綜合分析，Ra在 0.1～1.0 μm時(shí)，破骨細(xì)胞黏附、分化及吸收功能最強(qiáng)；但這個(gè)區(qū)間跨度仍然太大，具體的Ra值范圍以及各種材料之間（骨片、HA、TCP、鈦金屬等）的差異尚需進(jìn)一步研究。

3 材料表面微結(jié)構(gòu)對(duì)破骨細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制研究

3.1 材料表面微結(jié)構(gòu)對(duì)破骨細(xì)胞增殖與分化的影響

自20世紀(jì)90年代中期發(fā)現(xiàn)RANKL-核因子κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factorκB,RANK）-骨保護(hù)素（osteoprotegerin,OPG）系統(tǒng)以來，破骨細(xì)胞形成和激活主要通過RANKL-RANKOPG軸實(shí)現(xiàn)已成為共識(shí)[36]。破骨細(xì)胞的增殖與分化依賴于巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colonystimulating factor,M-CSF）和RANKL的協(xié)同作用。RANKL與RANK結(jié)合及其誘導(dǎo)破骨前體細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的過程受不同的蛋白與激酶調(diào)節(jié)，主要包括腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosisfactor receptor-associated factor 6，TRAF6）、核因子κB、激活蛋白-1、T細(xì)胞核因子1、整合素信號(hào)等。

細(xì)胞表面RANK-RANKL接觸機(jī)制在破骨細(xì)胞的分化過程中是必需的[37-38]。材料表面微結(jié)構(gòu)這一外界物理刺激對(duì)破骨細(xì)胞的調(diào)控作用同樣依賴于細(xì)胞-基質(zhì)的相互接觸。破骨細(xì)胞黏附于細(xì)胞外基質(zhì)以及細(xì)胞-細(xì)胞接觸主要是通過整合素αvβ3介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的[39-41]。阻斷整合素αvβ3會(huì)導(dǎo)致破骨細(xì)胞黏附減少[42-43]。Kim等[44]發(fā)現(xiàn)，M-CSF和OPN通過整合素αvβ3依賴性途徑促進(jìn)破骨細(xì)胞黏附和擴(kuò)散，依靠整合素αvβ3通過“內(nèi)向外”信號(hào)傳導(dǎo)和“外向內(nèi)”信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)行。M-CSF和RANKL在破骨細(xì)胞的成熟及分化中均起著重要作用，兩者協(xié)同促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成與分化，RANKL可提高破骨細(xì)胞膜表面整合素αvβ3的表達(dá)，M-CSF則通過整合素αvβ3傳導(dǎo)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化所需的信號(hào)，兩者可通過整合素αvβ3發(fā)揮生物效應(yīng)，從而調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的功能[45]。

在Makihira等[46]的研究中，在無RANKL誘導(dǎo)劑的情況下，破骨細(xì)胞分化指標(biāo)抗酒石酸酸性磷酸酶、組織蛋白酶K以及RANK、TRAF6、β-肌動(dòng)蛋白（RANK、TRAF6是RANKL調(diào)控破骨分化的靶點(diǎn)，β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參）等的表達(dá)均呈粗糙依賴性增加，進(jìn)一步表明材料表面粗糙度促進(jìn)了RANKL介導(dǎo)的破骨分化。同樣的，Costa-Rodrigues等[35]發(fā)現(xiàn)不同表面結(jié)構(gòu)對(duì)破骨細(xì)胞的調(diào)控作用依賴于破骨分化誘導(dǎo)因子，在與M-CSF、RANKL共培養(yǎng)的外周血單個(gè)核細(xì)胞中破骨細(xì)胞形成反應(yīng)隨表面粗糙度的增加而增加；而在與人骨髓細(xì)胞共培養(yǎng)的外周血單個(gè)核細(xì)胞中破骨細(xì)胞形成較低，但在共培養(yǎng)模型中補(bǔ)充破骨細(xì)胞生成誘導(dǎo)劑后，顯示出高水平或與前者類似水平的破骨細(xì)胞分化。由此可見，材料表面遞增的粗糙度增強(qiáng)了M-CSF和RANKL誘導(dǎo)的破骨分化。

綜上所述，破骨細(xì)胞可能通過整合素αvβ3識(shí)別材料表面微結(jié)構(gòu)這一外界信號(hào)，并激活黏著斑激酶，從而啟動(dòng)下游信號(hào)通路，由此材料表面微結(jié)構(gòu)可調(diào)控RANKL介導(dǎo)的破骨分化。

3.2 材料表面微結(jié)構(gòu)對(duì)破骨細(xì)胞功能活性相關(guān)蛋白的影響

破骨細(xì)胞吸收功能主要在于皺褶緣形成的封閉帶及肌動(dòng)蛋白環(huán)的組裝，破骨細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)因子主要有整合素 αvβ3、溶酶體、Src蛋白、OPG、Ephrin/Eph和Semaphorin信號(hào)通路及相關(guān)基因突變。在破骨細(xì)胞行使吸收功能的過程中，首先是破骨細(xì)胞對(duì)基質(zhì)或材料的識(shí)別、黏附，但具體機(jī)制尚不清楚。Davison等[20]發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞只吸收亞微米級(jí)表面結(jié)構(gòu)的TCPs而不吸收微米級(jí)結(jié)構(gòu)的TCPb，由此推斷破骨細(xì)胞吸收功能對(duì)TCP表面結(jié)構(gòu)的尺度高度敏感。

深入研究發(fā)現(xiàn)，材料表面不同的微結(jié)構(gòu)可影響破骨細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白環(huán)、黏著斑數(shù)量及其吸收功能活性。肌動(dòng)蛋白環(huán)是破骨細(xì)胞吸收裝置中封閉帶的主要成分，整合素αvβ3是封閉帶以及黏著斑形成的重要組分，也是介導(dǎo)破骨細(xì)胞黏附于基質(zhì)的主要蛋白[47]。αvβ3-PYK2-Src-p130是肌動(dòng)蛋白環(huán)形成的必要通路[48-49]，而黏著斑激酶是該信號(hào)通路激活的關(guān)鍵酶[50]。Costa-Rodrigues等[51]也發(fā)現(xiàn)，隨著HA表面粗糙度和復(fù)雜性的增加，黏著斑的數(shù)量隨之降低，與此一致，微粗糙的HA3表面培養(yǎng)的破骨細(xì)胞，其β-肌動(dòng)蛋白密封帶的數(shù)量及活性也隨之降低。

在上述研究中，表面結(jié)構(gòu)對(duì)破骨細(xì)胞形成和功能的影響體現(xiàn)在破骨細(xì)胞形態(tài)、肌動(dòng)蛋白環(huán)組裝和吸收凹坑形成等方面，材料表面粗糙度在一定范圍內(nèi)可增強(qiáng)破骨細(xì)胞功能，但粗糙度過大反而抑制其活性。TCP亞微米級(jí)表面結(jié)構(gòu)[Ra=（0.126±0.003）μm]相比于微米級(jí)表面結(jié)構(gòu)[Ra=（1.287±0.011）μm]能明顯激活破骨細(xì)胞功能活性[20]，而HA納米級(jí)表面結(jié)構(gòu)[Ra=（104.8±18.9）nm]相對(duì)于微米級(jí)表面結(jié)構(gòu)[Ra=（241±25.1）nm]則能明顯抑制破骨細(xì)胞功能活性[52]。因此，可通過精確量化各種材料表面結(jié)構(gòu)，以調(diào)控支架材料上破骨細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白環(huán)形成及其吸收功能活性。

不同粗糙度的表面結(jié)構(gòu)可導(dǎo)致培養(yǎng)的破骨細(xì)胞行為差異，細(xì)胞黏附、分化及吸收功能隨材料表面粗糙度的變化而變化，同時(shí)檢測到一些蛋白分子的表達(dá)也隨表面粗糙度的變化而改變。但其內(nèi)在機(jī)制均尚未清楚，具體的數(shù)量級(jí)也無明確界定，推測細(xì)胞反應(yīng)的差異可能與相關(guān)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)有關(guān)。未來有望通過材料表面物理微觀結(jié)構(gòu)對(duì)破骨細(xì)胞整合素αvβ3相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控闡明其作用機(jī)制，為制備性能更優(yōu)異的支架材料提供參考。

4 結(jié)語

無論是體外還是體內(nèi)研究，細(xì)胞與材料之間的相互作用均起于細(xì)胞與材料表面的接觸，細(xì)胞在材料表面的黏附和遷移決定了細(xì)胞的增殖和分化[52]?？赏ㄟ^材料表面物理微觀形貌調(diào)控細(xì)胞的黏附、遷移、增殖與分化以及相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞行為。

材料表面物理微觀形貌尤其是粗糙度對(duì)破骨細(xì)胞的調(diào)控作用顯著，Ra在0.1～1.0 μm時(shí)破骨細(xì)胞活性最強(qiáng)；Ra在0.2～2.0 μm時(shí)，用于光滑與粗糙表面細(xì)胞行為的對(duì)比研究最佳。關(guān)于材料微結(jié)構(gòu)啟動(dòng)骨誘導(dǎo)性及骨傳導(dǎo)性均已進(jìn)行了大量研究，其中材料微結(jié)構(gòu)啟動(dòng)骨誘導(dǎo)已得到證實(shí)，基于成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞在“體內(nèi)骨組織工程”以及“再生醫(yī)學(xué)”中的密切聯(lián)系，材料微結(jié)構(gòu)對(duì)破骨細(xì)胞的調(diào)控研究顯得尤為必要。因此，未來研究可測定一個(gè)合適的Ra值范圍，建立成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系，通過材料表面微結(jié)構(gòu)精確調(diào)控骨移植替代物植入部位的成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞行為，實(shí)現(xiàn)骨重塑，達(dá)到骨組織完全再生。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突