基于土壤宏基因組的新穎木聚糖酶基因克隆及生物信息學(xué)分析

魏琦超，王亞麗，張琛，趙加迪

（河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003）

木質(zhì)纖維素（lignocellulose）主要包括纖維素（cellulose）、半纖維素（hemicellulose）和木質(zhì)素（lignin），是自然界含量最豐富的生物質(zhì)原料。其中，纖維素的豐度最高，約占其總量的30%～50%；半纖維素的豐度次之，約占其總量的15%～35%[1-2]。半纖維素的主鏈由葡萄糖（glucose）、甘露糖（mannose）和木糖（xylose）等β-D-吡喃糖（pyranose）殘基通過(guò)β-1,4-糖苷鍵連接，可分為甘露聚糖（mannan）、木聚糖（xylan）和木葡聚糖（xyloglucans）3大類[3]。木聚糖由β-D-吡喃木糖通過(guò)β-1,4-糖苷鍵連接形成主鏈，是植物半纖維素的主要組分，約占植物干重的1/3[4]。

木聚糖酶（xylanase，EC.3.2.1.8）是一類能夠?qū)⒛揪厶墙到獬傻途勰咎呛蜕倭磕咎恰⒗牵╝rabinose）的一組酶系的總稱，在飼料、食品、化工等領(lǐng)域的用途非常廣泛[5]。王佳玉等[6]的研究表明，在全麥粉中木聚糖酶的添加量達(dá)到0.03%，經(jīng)過(guò)90min酶解反應(yīng)，面筋結(jié)構(gòu)可得到明顯改善。班志彬等[7]在肉雞的不同類型飼料中添加木聚糖酶，研究了對(duì)其生長(zhǎng)性能的影響，發(fā)現(xiàn)木聚糖酶可提高平均日增重并降低料重比。王陽(yáng)等[8]研究了木聚糖酶預(yù)處理對(duì)檀皮纖維漂白的影響，認(rèn)為預(yù)處理可有效疏松纖維結(jié)構(gòu)，提高后期處理過(guò)程中漂白劑的可及性，進(jìn)而提高檀皮纖維白度。

雖已在真菌、細(xì)菌、酵母菌、海藻和植物種子、甲殼類動(dòng)物、蝸牛等物種中發(fā)現(xiàn)了木聚糖酶[9-10]，但普遍認(rèn)為，真菌和細(xì)菌是該酶的主要來(lái)源[11]。利用基因工程異源表達(dá)木聚糖酶，可在一定程度上解決木聚糖酶原始來(lái)源微生物目標(biāo)酶表達(dá)量低、純化困難等酶生產(chǎn)和應(yīng)用領(lǐng)域的限制性因素。木聚糖酶基因傳統(tǒng)發(fā)掘方式為分離自然環(huán)境中的產(chǎn)酶微生物，經(jīng)純培養(yǎng)后克隆目標(biāo)基因。然而，就土壤微生物而言，其可培養(yǎng)微生物僅占1%～10%[12-13]，因此通過(guò)傳統(tǒng)方式分離木聚糖酶產(chǎn)酶菌株、發(fā)掘新穎木聚糖酶基因較為困難。

宏基因組最初是指土壤細(xì)菌混合基因組[14]。Rondon 等[15]以 細(xì)菌人工染色體（bacterial artificial chromosome，BAC）載體構(gòu)建了土壤宏基因組DNA文庫(kù)，文庫(kù)克隆的表型包括脂肪酶、淀粉酶、核酸酶等，該研究為基于土壤宏基因組發(fā)掘新穎工業(yè)、醫(yī)藥用酶基因奠定了基礎(chǔ)。本研究擬以土壤宏基因組DNA為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）模板，使用CODEHOP方法[16]設(shè)計(jì)木聚糖酶基因核心序列的簡(jiǎn)并引物，采用hiTAILPCR技術(shù)[17]獲悉其側(cè)翼序列，并最終克隆非培養(yǎng)木聚糖酶基因全長(zhǎng)序列，為有效利用土壤微生物資源，發(fā)掘新穎木聚糖酶基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品及采樣方法

土壤樣品采自河南科技學(xué)院校園內(nèi)常年潮濕的花壇土。除去地表植被和枯枝落葉，鏟除表面5cm左右的表土，取樣深度距土壤表面5～10cm，置于無(wú)菌采樣袋后帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 生化及分子生物學(xué)試劑

土壤基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)細(xì)胞、微柱濃縮DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司，2×Taq PCR MasterMix、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京博邁德基因技術(shù)有限公司，pMD?19-T Vector Cloning Kit、PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase 購(gòu) 自 Takara Bio，pEASY?-Blunt Zero Cloning Kit購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，瓊脂糖、50×TAE緩沖液，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 土壤宏基因組DNA的提取與質(zhì)量檢測(cè)

剔除土壤中的石礫和植物殘根等雜物，按照土壤基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取其DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)判斷所提取DNA樣品的完整性。使用微生物16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢驗(yàn)DNA樣品是否滿足PCR擴(kuò)增的純度要求。使用引物為 27F（5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）/1525R（5’AAGGAGGTGATCCAGCC）[18]。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，5min；95℃，30s；55℃，30s；72℃ 45s，30個(gè)循環(huán)；72℃，5min。

1.4 木聚糖酶基因核心序列的克隆與分析

1.4.1 簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)

在UniProt網(wǎng)站（https://www.uniprot.org/）以檢索詞“xylanase”檢索并下載登錄號(hào)為Q8GJ44、Q9HFH0、B3A0S5等的多條已公開(kāi)木聚糖酶氨基酸序列，使用CODEHOP設(shè)計(jì)基因核心區(qū)簡(jiǎn)并引物[19]。Xyn-GH10（F）：CTACGACTGGGAYGTNIBSAAYGA；Xyn-GH10（R）：GTGACTCTGGAWRCCIABNCCRT。下劃線為核心序列的簡(jiǎn)并區(qū)域，Y=C/T、N=A/T/G/C、I為次黃嘌呤、B=C/G/T、S=C/G、W=A/T、R=A/G。

1.4.2 核心序列擴(kuò)增

以經(jīng)27F/1525R檢測(cè)正常的土壤宏基因組DNA為模板，使用Xyn-GH10（F）/Xyn-GH10（R）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。鑒于核心序列擴(kuò)增用引物為簡(jiǎn)并引物，反應(yīng)程序采用降落PCR的方式進(jìn)行，即以66℃為首個(gè)循環(huán)的退火溫度；前15個(gè)循環(huán)，每循環(huán)的退火溫度降低1℃；以51℃為退火溫度循環(huán)25輪。

1.4.3 核心序列克隆與分析

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和切膠回收，膠回收產(chǎn)物與pMD?19-T克隆載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑取單克隆轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR鑒定后送測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)以下流程進(jìn)行分析：（1）測(cè)序結(jié)果去除簡(jiǎn)并引物序列；（2）多條測(cè)序結(jié)果使用Vector NTI的Alignment子程序進(jìn)行序列比對(duì)，如發(fā)現(xiàn)一致率為100%的序列，則僅保留一條序列用于后續(xù)分析；（3）序列提交至NCBI，使用blastx程序進(jìn)行同源序列檢索；（4）綜合考慮檢索到同源序列的注釋信息及序列一致率，篩選相關(guān)核心序列進(jìn)行側(cè)翼序列的擴(kuò)增。

1.5 候選核心區(qū)側(cè)翼序列的克隆

如表1所示，根據(jù)候選基因核心區(qū)測(cè)序結(jié)果，按照hiTAIL-PCR特異性引物設(shè)計(jì)規(guī)則，設(shè)計(jì)3條特異性上游引物和3條特異性下游引物，分別與hiTAILPCR通用引物配合使用，擴(kuò)增核心區(qū)3’端和5’端側(cè)翼序列。

1.6 木聚糖酶基因編碼區(qū)全長(zhǎng)序列的克隆

將前期克隆的木聚糖酶基因核心區(qū)及其5’端、3’端側(cè)翼序列進(jìn)行拼接，根據(jù)拼接序列，設(shè)計(jì)2對(duì)引物（表2），以前期相應(yīng)的土壤宏基因組DNA為模板，通過(guò)巢式PCR擴(kuò)增木聚糖酶基因編碼區(qū)全長(zhǎng)序列。

表1 側(cè)翼序列擴(kuò)增用引物

表2 編碼區(qū)全長(zhǎng)序列擴(kuò)增用引物

1.7 木聚糖酶基因編碼區(qū)序列的生物信息學(xué)分析

克隆序列經(jīng)DNAMAN軟件翻譯為氨基酸序列后，使用各工具網(wǎng)站（表3）進(jìn)行同源序列的比對(duì)和理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)等的分析。

表3 生物信息學(xué)分析用工具網(wǎng)站

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤宏基因組DNA的質(zhì)量檢測(cè)

土壤中因富含腐殖酸、多酚等雜質(zhì)，其高質(zhì)量微生物總DNA的提取頗有困難困難較大。本研究使用試劑盒法提取總DNA。所提樣品經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。發(fā)現(xiàn)其條帶單一，泳道內(nèi)無(wú)彌散、降解現(xiàn)象，初步認(rèn)為可滿足PCR擴(kuò)增對(duì)模板質(zhì)量的要求。為了進(jìn)一步驗(yàn)證模板質(zhì)量，以微生物16S rRNA通用引物27F/1525R擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示?？梢钥吹綌U(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰、符合預(yù)期大小，因此所提取DNA可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 土壤宏基因組DNA的電泳檢測(cè)

2.2 木聚糖酶基因核心序列的PCR擴(kuò)增

目標(biāo)基因編碼區(qū)核心序列的擴(kuò)增，是獲得其全長(zhǎng)的必要條件。本研究使用CODEHOP方式設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物、通過(guò)降落PCR的方式開(kāi)展上述工作。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得長(zhǎng)度約為250bp（base pairs，堿基對(duì)）的電泳條帶（圖3），認(rèn)為其符合CODEHOP簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)的預(yù)期大小。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后，連入T載體，隨機(jī)挑取15個(gè)單克隆經(jīng)PCR檢測(cè)后送武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定工作。

圖2 16S rRNAPCR 檢測(cè)

圖3 木聚糖酶基因核心序列PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)

2.3 木聚糖酶基因核心序列的新穎性分析

將核心序列測(cè)序結(jié)果去除簡(jiǎn)并引物及其外側(cè)序列，使用blastx程序進(jìn)行同源序列檢索，發(fā)現(xiàn)有3條序列與非全長(zhǎng)的未培養(yǎng)微生物GH10家族（glycosyl hydrolase family 10）木聚糖酶氨基酸序列具有較高的一致率，認(rèn)為其具有一定的新穎性。編號(hào)為Xyn10-3的核心序列，其一致率最高（70.59%）的序列為未培養(yǎng)微生物來(lái)源木聚糖酶（ACR24800），將其作為目標(biāo)序列，開(kāi)展編碼區(qū)全長(zhǎng)序列的克隆工作。

2.4 Xyn10-3編碼區(qū)全長(zhǎng)序列的克隆

根據(jù)Xyn10-3核心序列設(shè)計(jì)特異性引物，采用hiTAIL-PCR方式克隆其5'端和3'端側(cè)翼序列。根據(jù)獲悉的側(cè)翼序列信息，設(shè)計(jì)巢式PCR引物進(jìn)行編碼區(qū)全長(zhǎng)序列的克隆。經(jīng)過(guò)兩輪PCR，克隆到Xyn10-3 的完整開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），全長(zhǎng)為 1 284bp（表4）。

2.5 Xyn10-3編碼區(qū)序列的生物信息學(xué)分析

將Xyn10-3編碼區(qū)核苷酸序列進(jìn)行blastx檢索，其編碼的氨基酸序列與海洋放線菌（Actinoalloteichuscyanogriseus）β-1,4-內(nèi) 切 木 聚糖酶的一致率最高，且僅為51.43%，表明所克隆的Xyn10-3編碼區(qū)為未知的新序列。NCBI的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果（圖4）顯示：Xyn10-3的295-1272位氨基酸為β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶結(jié)構(gòu)域，E值（E-value）為8.22E-61，認(rèn)為其預(yù)測(cè)可靠。

圖4 Xyn10-3的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

將Xyn10-3編碼區(qū)核苷酸序列翻譯為氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其共有427aa，分子量為47398.91Da，理論等電點(diǎn)為8.99。各氨基酸位點(diǎn)的親疏水系數(shù)如圖5所示，平均親水系數(shù)（GRAVY）為-0.287，可判斷為親水蛋白。蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域分析結(jié)果（圖6）表明，該蛋白可能不存在跨膜區(qū)域。

圖5 氨基酸疏水性分析

圖6 蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域分析

表4 Xyn10-3編碼區(qū)核苷酸序列信息

3 結(jié)論

傳統(tǒng)的新酶發(fā)掘技術(shù)方案，通常以目標(biāo)性狀微生物的分離、篩選為起始環(huán)節(jié)。為了充分利用土壤未培養(yǎng)微生物蘊(yùn)藏的海量基因資源，本研究嘗試使用CODEHOP方法設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物先行克隆目標(biāo)酶基因的編碼區(qū)核心序列，繼而使用hiTAIL-PCR方式獲悉其旁側(cè)DNA序列信息，最終通過(guò)巢式PCR的方式克隆全長(zhǎng)的編碼區(qū)DNA序列。所克隆Xyn10-3經(jīng)生物信息學(xué)分析，認(rèn)為其是一個(gè)未報(bào)道的木聚糖酶全長(zhǎng)基因。后續(xù)將構(gòu)建pGAPZαA-Xyn10-3重組質(zhì)粒，并進(jìn)行畢赤酵母（Pichia pastoris）工程菌株的構(gòu)建和目標(biāo)蛋白的表達(dá)、純化等工作，以進(jìn)一步檢測(cè)其酶活。