呋喃妥因代謝物膠體碳免疫試紙條制備與應(yīng)用

曾艷，吳爍

（天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

呋喃妥因（NFT）又名硝呋妥因和呋喃坦丁等，為黃色結(jié)晶性粉末，無臭，遇光色漸變深，曾作為預(yù)防和治療胃腸道感染的抗菌藥在禽類、水產(chǎn)和家畜中廣泛使用[1]。NFT內(nèi)服后會在體內(nèi)迅速代謝，代謝產(chǎn)物為1-氨基-乙內(nèi)酰脲（AHD）。AHD可以與組織蛋白質(zhì)結(jié)合，形成穩(wěn)定的結(jié)合物，在動物體內(nèi)殘留數(shù)周之久，被人攝入后，可經(jīng)人胃消化轉(zhuǎn)移至人體內(nèi)[2]，1-（2-硝基苯亞甲基）-氨基乙內(nèi)酰脲（NPAHD）為其衍生物。范菲等[3]通過研究呋喃妥因及有關(guān)物質(zhì)對大鼠的長期毒性，推斷大劑量呋喃妥因有溶血作用，會對腎、肝、心產(chǎn)生不利影響。歐盟已將所有的硝基呋喃類抗生素全部列為違禁藥物，我國也明確將其列為飼養(yǎng)過程中禁止使用的藥物，在動物性食品中不得檢出[4]。衛(wèi)生部于2010年將呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林列入可能違法添加的非食用物質(zhì)黑名單，加強(qiáng)監(jiān)管。

早期呋喃妥因的檢測大多是針對原藥，結(jié)果均不理想，現(xiàn)在多檢測動物組織中的AHD含量，間接反映原藥使用的殘留情況。目前應(yīng)用最廣泛的儀器分析方法主要有高效液相色譜（HPLC）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）等。國家發(fā)布的GB/T20752-2006、GB/T21311-2007以及農(nóng)業(yè)部公告第235號等均采用LC-MS/MS法。該法適用范圍覆蓋水產(chǎn)品、肌肉組織、動物內(nèi)臟、蜂蜜和腸衣農(nóng)產(chǎn)品等。

免疫分析作為一種既特異又敏感的檢測方法，在食品中藥物殘留檢測中被廣泛應(yīng)用。彭鵬[5]使用膠體金技術(shù)研制的呋喃妥因代謝物AHD膠體金試紙條檢測限為5 μg/kg（以NPAHD計），檢測時間約10 min；動物源性食品檢測限為0.8 μg/kg，以AHD計。

炭黑是一種由類球形小粒子構(gòu)成的具有局部石墨化結(jié)構(gòu)的無定形炭。炭黑表面存在一定的有機(jī)官能團(tuán)，包括羧基、酚羥基、羰基等。1993年，炭黑首次作為標(biāo)記物用于免疫分析[6]。何卓等[7]制作膠體碳試紙條用于檢測瘧原蟲，以檢測帶的灰度值定量。與膠體金的紅色相比，膠體碳試紙條反應(yīng)后的黑色與白色的硝酸纖維素膜形成更大的顏色反差，更易辨別[8]?；诖?，利用膠體碳作為標(biāo)記物標(biāo)記抗體，建立硝基呋喃類藥物殘留的免疫層析試紙條方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1-氨基-乙內(nèi)酰脲-BSA偶聯(lián)物、1-氨基-乙內(nèi)酰脲單克隆抗體、羊抗鼠二抗體、NPAHD、牛血清白蛋白（BAS）（美國Sigma公司）；硝酸纖維素膜（HF90，HF135）、GFCP 203000玻璃纖維墊（美國Millipore公司）；SB06玻璃纖維素膜、吸水紙、PVC背板（上海金標(biāo)生物科技有限公司）；SB4炭黑（德國德固賽公司）；多寶魚、鱸魚、鯽魚、草魚4種水產(chǎn)品，均于超市購買。LTI-700低溫恒溫培養(yǎng)箱（上海EYELA）；VT 6025真空干燥箱（天津三水儀器有限公司）；5804A冷凍離心機(jī)（德國EPPENDORF公司）；BL610分析天平（賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；HM3030雙維往復(fù)劃膜儀、ZQ2002微電腦自動斬切機(jī)（上海金標(biāo)生物科技有限公司）。

1.2 溶液制備

BB（0.01mol/L pH7.6）：準(zhǔn)確稱取 1.051 45 g 硼酸和 0.286 05 g硼砂，加水定容至 2L；PB（0.1mol/L pH7.4）：準(zhǔn)確稱取2.964g磷酸二氫鈉和29.011g磷酸氫二鈉，加水定容至 1L；PB（0.01 mol/L pH7.6）：準(zhǔn)確稱取0.202 8g磷酸二氫鈉和3.116 0g磷酸氫二鈉，加水定容至1L； PBS：準(zhǔn)確稱取9g NaCl溶于1L相應(yīng)濃度 PB 溶液； PBST（0.1 mol/L pH 8.0）：準(zhǔn)確稱取 10gBSA，1ml吐溫 -20 和 0.2g 疊氮鈉，0.826 8 g磷酸二氫鈉和33.917 8 g磷酸氫二鈉，加水定容至1L，上述溶液均在4℃保存。

1.3 實驗方法

1.3.1 碳納米顆粒分散溶液的選擇

稱取適量炭黑固體，分別加入到一定pH值和濃度的磷酸鹽緩沖液（PBS）、硼酸鹽緩沖液（BB）和磷酸緩沖液（PB）中，冰浴超聲20 min，配制成膠體碳溶液，室溫下靜置一段時間，觀察碳顆粒在緩沖體系中的分散性和穩(wěn)定性。

1.3.2 膠體碳標(biāo)記抗體的制備

（1）將1-氨基-乙內(nèi)酰脲單克隆抗體用選擇出的分散溶液稀釋至5 mg/mL。

（2）緩慢攪拌條件下將一定量抗體加入到適量膠體碳溶液中，4 ℃條件下緩慢攪拌過夜。

（3）混合液體全部轉(zhuǎn)移至離心管中并記錄體積，在 14 000 r/min、4 ℃、條件下離心 15 min，棄去上清夜，并用緩沖液重復(fù)洗滌2次。最終沉淀用洗滌緩沖液重懸至初始體積，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 膠體碳標(biāo)記免疫層析試紙條檢出限的確定

配制一系列濃度的NPAHD標(biāo)準(zhǔn)品溶液：0 μg/L、0.1 μg/L、0.2 μg/L、0.3 μg/L、0.5 μg/L、0.7 μg/L、1.0 μg/L和2.0 μg/L，與膠體碳標(biāo)記抗體混合后，吸取100 μL跑條，選擇檢測線顏色與空白對照檢測線顏色有明顯差別時的最低標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為試紙條檢出限。

1.3.4 膠體碳標(biāo)記免疫層析試紙條特異性測試

選取硝基呋喃類及其衍生物與其他獸藥共計14種，用制備好的試紙條進(jìn)行檢測，以確定其特異性。

1.3.5 試紙條對實際樣品的檢測效果

1.3.5.1 實際樣品前處理方法

將多寶魚、鱸魚、鯽魚、草魚4種不同動物組織的樣品切碎，用勻漿機(jī)在4 000 r/min條件下均質(zhì)5 min后進(jìn)行衍生處理和萃取處理[5]。

衍生處理：稱5.0 g的樣品于50 mL離心管中，加入 10 mL 去離子水和 2 mL 的 1 mol/L HCl溶液，混勻后加入300 μL的鄰硝基苯甲醛溶液（50 mmol/L），混勻，置于 60oC 水浴中，反應(yīng) 180 min。

萃取處理：將衍生后的樣品取出恢復(fù)至室溫，加 入 5 mL 的 PBS（0.2 mol/L） 和 1.6 mL 的 NaOH（1 mol/L）溶液，調(diào)節(jié)pH至中性；再加入 7 mL乙酸乙酯，漩渦混勻 30 s后在 5 000 r/min 條件下離心 10 min，取上層即乙酸乙酯層于10 mL離心管中，50oC氮氣吹干；加2 mL正己烷復(fù)溶后加入1 mL的PBS緩沖溶液，震蕩混勻后于 5 000 r/min 條件下離心 10 min，上層正己烷層棄掉，下層溶液檢測用。

1.3.5.2 實際樣品添加回收試驗

經(jīng)檢驗，多寶魚、鱸魚、鯽魚、草魚4種樣本的組織中均不含NFT及其代謝物AHD。向樣品中分別添加AHD標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為0 μg/kg，0.2 μg/kg，0.5 μg/kg的。采用1.2.5.1的處理方法處理，使用試紙條檢測以確定實際樣本的檢測限。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳納米顆粒分散溶液的選擇

（1）由于炭黑顆粒表面含較多的羧基，優(yōu)先選擇pH為7.6的緩沖液進(jìn)行分散。稱3 mg炭黑，分別加入到 10 mL濃度為0.01 mol/L、pH為7.6的 BB、PBS、PB緩沖液中，冰浴超聲20 min，形成濃度為0.3 mg/mL的膠體碳溶液。室溫下靜置24 h，3種溶液均未出現(xiàn)明顯分層、沉淀。

（2）將上述膠體碳溶液參照1.2.2方法標(biāo)記1-氨基-乙內(nèi)酰脲單克隆抗體，并組裝試紙條，檢測結(jié)果見圖1。PBS和PB溶解的碳納米顆粒標(biāo)記抗體，試紙條檢測線和質(zhì)控線顏色很淡，肉眼辨識困難。BB緩沖液溶解的試紙條能較好顯色，并對不同濃度的標(biāo)液呈現(xiàn)顏色梯度。因此，選擇BB緩沖液作為碳納米顆粒的分散溶液。

圖1 碳納米顆粒分散溶液的選擇

2.2 膠體碳標(biāo)記免疫層析試紙條檢出限的確定

使用0.1 mol/L、pH為7.4的PBS緩沖液稀釋包被抗原8倍、羊抗鼠二抗70倍，選擇Millipore135s膜，噴涂量為0.8 μL/cm，干燥后組裝試紙條。配制一系列濃度的NPAHD標(biāo)準(zhǔn)品溶液，吸取4 μL膠體碳標(biāo)記抗體與標(biāo)準(zhǔn)品混勻，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（0.1 mol/L、pH為8.0的PBST）定容至100 μL上樣，結(jié)果如圖2所示。添加標(biāo)準(zhǔn)品濃度達(dá)到0.5 μg/L時，檢測線和質(zhì)控線有明顯差異，當(dāng)加標(biāo)量到達(dá)1.0 μg/L時，檢測線徹底消失。多次重復(fù)試驗表明：該試紙條目測時檢出限為 1.0 μg/L。

圖2 試紙條檢出限的確定

2.3 膠體碳標(biāo)記免疫層析試紙條特異性測試

添 加 NPAHD、NPPAOZ、NPAMOZ、NPSEM、呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、AHD、AOZ、AMOZ、SEM、鄰硝基苯甲醛、對硝基苯甲酸檢測，試紙條結(jié)果見圖3。添加呋喃妥因和AHD時，試紙條檢測線消線顯著，可以認(rèn)作有較低的交叉，可能是由免疫原的主體結(jié)構(gòu)與原藥及AHD的相似所致，其他藥物的濃度高達(dá)1 000μg/L，檢測線仍正常顯色，即沒有交叉反應(yīng)。

圖3 試紙條與其他獸藥的交叉反應(yīng)

2.4 膠體碳標(biāo)記免疫層析試紙條實際樣品的檢測

分別向4種陰性樣品中添加濃度為0 μg/kg、0.2 μg/kg、0.5 μg/kg的AHD標(biāo)準(zhǔn)品。加標(biāo)樣品按1.2.5.1方法處理，試紙條檢測結(jié)果見圖4。4個空白本底樣的檢測線和質(zhì)控線均能正常顯色，且一致性好；加標(biāo)樣的檢測線顏色均明顯低于質(zhì)控線，實驗中將檢測線徹底消失時的添加量作為樣品的檢出限濃度，則這4種樣品的檢出限均至少能達(dá)到0.2 μg/kg。

圖4 4種實際樣品中AHD的檢測

3 結(jié)論

（1）采用PB、BB和PBS溶液開展了碳納米顆粒分散試驗，結(jié)果表明BB緩沖液為最佳膠體碳分散液，最佳pH值為7.6，離子濃度為5 mmol/L。

（2）實驗建立了膠體碳標(biāo)記免疫層析分析方法，試紙條選擇Millipore135s膜作為膜載體，包被抗原稀釋比例為1∶8，羊抗鼠二抗稀釋比例為1∶70，均選擇pH為7.4的0.1 mol/L PBS進(jìn)行稀釋，跑條緩沖液選擇pH為8.0的0.1 mol/L PBST，反應(yīng)時間控制在 10～15 min。

（3）選擇無殘留的水產(chǎn)品做本底，添加AHD，經(jīng)衍生化、萃取，產(chǎn)物經(jīng)由試紙條檢測，檢出限為0.2 μg/kg。

（4）試紙條使用步驟簡單，無需借助儀器，目測即可得出結(jié)果，可適用于大量樣品的快速篩選。