方玲 湯強(qiáng) 韓永斌

富硒杏鮑菇液體菌種深層發(fā)酵條件優(yōu)化

方玲1湯強(qiáng)1韓永斌2

（1.蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，安徽蕪湖，241003；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京，210095）

不同的發(fā)酵條件對杏鮑菇Pe-6菌株的深層發(fā)酵有不同的影響。在溫度為25℃、初始pH為6.0、接種量為12%、裝液量為40%的培養(yǎng)條件下，Pe-6杏鮑菇的菌絲體生物量和硒含量最大。同時，試驗結(jié)果表明，最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為黃豆粉，最佳無機(jī)鹽為KH2PO4和MgSO4·7H2O。最終的正交實(shí)驗得出杏鮑菇液體發(fā)酵最優(yōu)培養(yǎng)基組合為：2%葡萄糖、3%黃豆粉、0.1% KH2PO4及0.05% MgSO4·7H2O。采用上述研究分析得出的最優(yōu)培養(yǎng)基開展驗證實(shí)驗，得出菌絲體生物量為10.15 mg/mL，較培養(yǎng)基優(yōu)化前的數(shù)值提高29.13%；菌株硒含量為2138.52 μg/g，較優(yōu)化前的1642.36 μg/g提高了30.21%。

富硒杏鮑菇；發(fā)酵條件；深層發(fā)酵。

硒對人體最主要的功能為提高免疫力、抗氧化以及抗癌作用。當(dāng)前，利用食用菌開發(fā)大量富硒保健食品和藥品的研究紛紛涌現(xiàn)[1,2]。杏鮑菇是聯(lián)合國糧農(nóng)組織向全世界推薦的食用菌品種，具有巨大的推廣應(yīng)用價值[6]。利用杏鮑菇液體發(fā)酵培養(yǎng)替代固體種子栽培生產(chǎn)，具有接種便捷、生產(chǎn)周期短和不易污染等優(yōu)點(diǎn)；得到的次生代謝產(chǎn)物含量更高，代謝產(chǎn)物種類豐富，具備更強(qiáng)的生物學(xué)功能，最終產(chǎn)品的形式更加適應(yīng)市場的需求[3]。因此，本研究以杏鮑菇為研究對象，利用深層發(fā)酵工藝，進(jìn)行深入的理論分析和實(shí)驗研究，對富硒杏鮑菇液體菌種深層發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，提高富硒率，為進(jìn)一步研究杏鮑菇硒含量奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

1.1.1供試菌株

前期菌種篩選得到最優(yōu)杏鮑菇菌株：Pe-6。

1.1.2液體基本培養(yǎng)基

培養(yǎng)基組分：2%葡萄糖、1%酵母粉、2%黃豆粉、0.05 % MgSO4·7H2O和0.05 % KH2PO4。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1培養(yǎng)條件篩選優(yōu)化

1.2.1.1 培養(yǎng)溫度對杏鮑菇菌株P(guān)e-6硒含量產(chǎn)量及生物量的影響

將接種菌株P(guān)e-6分別置于20 ℃、22 ℃、25 ℃、28 ℃和30 ℃不同溫度下的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，添加50 μg/g濃度的硒含量，接種量統(tǒng)一為10 %，pH自然（pH為6.5 ～ 7.0，下同），150 r/min下振蕩培養(yǎng)7天，測其菌絲體生物量和富硒量。

1.2.1.2 接種量對杏鮑菇菌株P(guān)e-6硒含量產(chǎn)量及生物量的影響

分別以8%、10%、12%、14%和16%的接種量將菌株P(guān)e-6接入液體培養(yǎng)基，添加50 μg/g濃度的硒含量；在25 ℃、pH自然、150 r/min 的條件下培養(yǎng)7天，測其菌絲體生物量和富硒量。

1.2.1.3 初始 pH 值對杏鮑菇菌株P(guān)e-6硒含量產(chǎn)量及生物量的影響

將培養(yǎng)基初始pH 值分別調(diào)至4.5、5.0、5.5、6.0和6.5，添加50 μg/g濃度的硒含量；在25 ℃、pH自然、150 r/min 的條件下培養(yǎng)7天，測其菌絲體生物量和富硒量。

1.2.2基質(zhì)配方篩選優(yōu)化

1.2.2.1碳源篩選

將濃度2%的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖和玉米粉加入碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，裝液量100 mL/250 mL三角瓶，12%的接種量，添加50 μg/g濃度的硒含量；在pH 6.0，25 ℃，150 r/min 的條件下培養(yǎng)7天，測其菌絲體生物量和富硒量。

1.2.2.2 氮源篩選

分別選用蠶蛹粉、酵母浸出粉、黃豆粉、蛋白胨和麩皮作為氮源，按照濃度2%加入氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，裝液量40%，接種量為12%，添加50 μg/g濃度的硒含量，在pH 6.0、25 ℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)7天，測其菌絲體生物量和富硒量。

1.2.2.3 無機(jī)鹽篩選

選用濃度0.05%的NaH2PO4、KH2PO4、KCl、K2HPO4和MgSO4·7H2O加入無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，裝液量100 mL/250 mL三角瓶，12%接種量，添加硒含量的濃度為50 μg/g，在pH值6.0、25 ℃、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)7天，測量菌絲體生物量和富硒量。

1.2.2.4 正交試驗優(yōu)化

根據(jù)上述單因素優(yōu)化試驗結(jié)果，通過DPS軟件進(jìn)行試驗設(shè)計復(fù)選，并以生物量和硒含量為指標(biāo)，最終得到最佳培養(yǎng)基組合配方。（詳見表1）

表1 基質(zhì)配方正交試驗設(shè)計因素水平表L9（34）

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.1.1不同培養(yǎng)溫度對菌絲體生物量和富硒量的影響

食用菌菌絲的生長受溫度影響較大。溫度升高，菌體生長加速；溫度過高也會對菌體的生長和硒含量的形成產(chǎn)生負(fù)面影響[4]。

培養(yǎng)溫度優(yōu)化實(shí)驗由表2得出，25 ℃時，可以得到最大菌體生物量，達(dá)到7.05 mg/mL；隨著溫度不斷升高，生物量逐漸下降。但在28℃時硒含量卻達(dá)到最大值1320.62 μg/g，與25 ℃時的產(chǎn)量1289.47 μg/g相比產(chǎn)量值相差較小。故經(jīng)綜合考慮，最終確定最佳培養(yǎng)溫度為25 ℃。

2.1.2 不同接種量對菌絲體生物量和富硒量的影響

分別以10%、12%、14%、16%和18%5個不同接種量濃度接種菌株，實(shí)驗最終結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，接種量達(dá)到10%時得到的生物量最少，接種量達(dá)到18%時得到的生物量高；當(dāng)接種量為12%時，其硒含量達(dá)到最高值1263.42 μg/g。綜合考慮生物量和富硒量，最終選擇的最優(yōu)接種量為12%。

表3 接種量對菌絲體生物量和富硒量的影響

2.1.3 不同培養(yǎng)基初始 pH 值對菌絲體生物量和富硒量的影響

由表4可以看出，起始pH為6.0時，該菌株的生物量和硒含量的產(chǎn)量最高，分別達(dá)到7.36 mg/mL 和1386.52 μg/g，與其他組差異達(dá)極顯著水平（P < 0.01），其余依次為pH值為5.0、7.0、4.0和8.0時的產(chǎn)量。當(dāng)pH在5.0 ～ 6.0之間時，菌株產(chǎn)生的富硒量在1267.26 μg/g以上；當(dāng)pH大于6.0時，富硒量明顯下降；在pH為8.0時，富硒量僅為829.38μg/g。

表4 不同初始pH值對菌絲體生物量和富硒量的影響

2.2 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

2.2.1不同碳源、氮源、無機(jī)鹽對菌絲體生物量和富硒量的影響

以菌絲體生物量和硒含量為指標(biāo)對杏鮑菇液體菌種培養(yǎng)基的碳源、氮源以及無機(jī)鹽進(jìn)行篩選，結(jié)果見表5、表6和表7。

表5 不同碳源對對菌絲體生物量和富硒量的影響

表6 不同氮源對菌絲體生物量和富硒量的影響

表7 無機(jī)鹽對對菌絲體生物量和富硒量的影響

從表5得出，葡萄糖為碳源時，菌株P(guān)e-6硒含量的產(chǎn)量達(dá)到最高，為1876.45 μg/g，生物量也較高，因此確定最佳碳源為葡萄糖。從表6得出，以黃豆粉為氮源培養(yǎng)時，綜合考慮生物量和硒含量的產(chǎn)量，并從原料價格角度考慮，最終確定富硒培養(yǎng)基的最佳氮源為黃豆粉。從表7可以看出，綜合考慮生物量和硒含量的產(chǎn)量，確定KH2PO4和MgSO4·5H2O為最佳無機(jī)鹽。因此，正交試驗的重要影響因子為葡萄糖、黃豆粉、KH2PO4和MgSO4·5H2O。

2.2.2正交試驗確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組合

通過正交實(shí)驗得出（表8），四個因素對菌株P(guān)e-6菌絲體生物量的影響大小分別依次為：黃豆粉（B）> 葡萄糖（A）> MgSO4·5H2O（D）> KH2PO4（C）。統(tǒng)計分析結(jié)果表明：在以生物量為指標(biāo)試驗中，四個因素的最佳組合為A2B2C3D1，菌絲體生物量達(dá)到10.15 mg/mL，與其他組差異達(dá)極顯著水平（P < 0.01），最佳培養(yǎng)基組成為2%葡萄糖、3%黃豆粉、0.05% MgSO4·7H2O及0.025% KH2PO4。

表8 生物量直觀分析結(jié)果

從表9可以看出，試驗中選擇的四個因素對硒產(chǎn)量的影響大小依次是：葡萄糖（A）> MgSO4·5H2O（D）>黃豆粉（B）> KH2PO4（C）。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，試驗中四個因素的最佳組合為A2B3C1D2，即2%葡萄糖、3%黃豆粉、0.1% KH2PO4和0.05% MgSO4·7H2O，此種組分的培養(yǎng)基為硒產(chǎn)量達(dá)到最佳時的培養(yǎng)基。

表9 以富硒量為指標(biāo)的正交表及直觀分析結(jié)果

綜合考慮上述菌絲體生物量、硒含量，以及生產(chǎn)成本等因素，最佳杏鮑菇富硒的培養(yǎng)基組成為：2%葡萄糖、3%黃豆粉、0.1% KH2PO40和0.05% MgSO4·7H2O。

2.2.3驗證試驗

采用上述優(yōu)化得到的最佳培養(yǎng)基組合進(jìn)行驗證，結(jié)果得到菌絲體生物量為10.15 mg/mL，比優(yōu)化前的7.86 mg/mL提高了29.13%。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析顯示，兩者之間具有極顯著差異；同時，菌株硒含量產(chǎn)量為2138.52 μg/g，比優(yōu)化前的數(shù)值提高了30.21%，兩者之間具有極顯著差異。

3 討論

目前，國內(nèi)對于杏鮑菇的研究主要以子實(shí)體居多，但子實(shí)體栽培存在成本高、周期長等缺點(diǎn)，在某種程度上限制了杏鮑菇研究的廣泛推廣[5]。相較而言，液體深層發(fā)酵培養(yǎng)表現(xiàn)出出菇質(zhì)量高、生產(chǎn)周期短、菌絲萌發(fā)快等顯著優(yōu)勢，大大降低了生產(chǎn)成本。并且，大量研究表明在營養(yǎng)成分及含量方面食用菌子實(shí)體和菌絲體差異較小[7]。利用發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)出富硒食用菌，繼而加工成為補(bǔ)硒的功能食品、保健品和藥品，己被證實(shí)為目前為止最安全可靠的技術(shù)方法[8-9]。因此，改變傳統(tǒng)杏鮑菇菌種生產(chǎn)工藝、推廣液體培養(yǎng)，可以促進(jìn)杏鮑菇產(chǎn)業(yè)的全面升級。

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Optimization of the Conditions for Deep Fermentation of Se-enriched Pleurotus Eryngii

FANG Ling & TANG Qiang & HAN Yongbing

The different fermentation conditions have different influence on deep fermentation of Pleurotus eryngii Pe-6 strain. In the condition of the culture temperature 25 ℃, initial pH 6.0 naturally, inoculum size 12% and loaded liquid 40%, mycelia biomass and Se-content of Pleurotus eryngii Pe-6 strain were maximized. Meanwhile, experiment results show that the best carbon source is glucose; the best nitrogen source is soybean meal; the best inorganic salts are KH2PO4and MgSO4·7H2O. Finally, the orthogonal experiment proves that the best medium for Pleurotus eryngii submerged fermentation medium consists of 2% glucose, 3% soybean meal, 0.1% KH2PO4and 0.05% MgSO4.7H2O. Through the verified experiment in which the best medium mentioned above was adopted, the results show that the mycelia biomass weights 10.15 mg/mL, 29.13% compared with the value before optimization; the Se-content reaches up to 2138.52 μg/g, improving by 30.21% compared with 1642.36 μg/g before optimization.

Se-enriched Pleurotus eryngii; fermentation conditions; deep fermentation.

S318

A

1009-1114（2020）04-0015-05

2020-05-20

1. 方玲（1982—），女，安徽蒙城人，碩士，蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院講師，研究方向為食用菌開發(fā)及其教學(xué)。

2. 湯強(qiáng)（1981—），安徽蕪湖人，博士，蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院教授，研究方向為微生物學(xué)。

研究項目：安徽省高校自然科學(xué)研究重點(diǎn)項目（KJ2017A556）；安徽省教育廳質(zhì)量工程教學(xué)研究重點(diǎn)項目（2018jyxm0177）；安徽省教育廳質(zhì)量工程校企合作示范實(shí)訓(xùn)中心項目（2019xqsxzx15）。

文稿責(zé)編 蕭晟