方來杉，賴 強(qiáng)，鐘澤民，黃毓茂,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣州沃德生物技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510663）

乳酸菌在自然環(huán)境中廣泛存在，在人類胃腸道健康中發(fā)揮著重要作用[1-3]。乳酸菌可以促進(jìn)人體胃腸道對(duì)乳糖的消化吸收，減少胃腸功能紊亂，增強(qiáng)細(xì)胞免疫力，有助于預(yù)防結(jié)腸癌[4-6]，與人類飲食和健康息息相關(guān)。是現(xiàn)代食品、醫(yī)療制藥、農(nóng)牧等行業(yè)中具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的益生菌。

多數(shù)乳酸桿菌攜帶有數(shù)個(gè)質(zhì)粒，大小不一，其中多數(shù)質(zhì)粒為隱蔽性質(zhì)粒，少數(shù)質(zhì)粒具有某些特殊功能[7]。目前，已有許多乳桿菌質(zhì)粒被測序，并用于構(gòu)建質(zhì)粒載體，如副干酪乳桿菌的質(zhì)粒pCD01和pCD02[8]、干酪乳桿菌的質(zhì)粒pLC494[9]和pMC11[10]、植物乳桿菌質(zhì)粒pD403[11]和pM4[12]等。乳酸桿菌質(zhì)粒復(fù)制方式為滾環(huán)復(fù)制和θ復(fù)制，通常較小的質(zhì)粒（＜12 kb）通過滾環(huán)方式進(jìn)行復(fù)制[13]。通過對(duì)乳酸菌質(zhì)粒的測序、分析，得到乳酸菌質(zhì)粒的復(fù)制子是構(gòu)建質(zhì)粒載體的關(guān)鍵。國內(nèi)開展的乳酸菌天然質(zhì)粒的分離及功能分析的研究較少，導(dǎo)致利用基因工程手段對(duì)乳酸桿菌的改良受到嚴(yán)重限制。由于乳酸菌是食品級(jí)的益生菌，其攜帶的質(zhì)粒也是食品級(jí)的[14]，不存在食品安全問題。

因此，本研究對(duì)從酸菜中分離的植物乳桿菌LP3中的內(nèi)源性質(zhì)粒pLP3進(jìn)行全序列測定及功能分析，并利用該質(zhì)粒的復(fù)制子構(gòu)建大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒D-pLP3，并研究該質(zhì)粒的宿主范圍、轉(zhuǎn)化效率和穩(wěn)定性。在穿梭質(zhì)粒pLP3的基礎(chǔ)上加上啟動(dòng)子PslpA和綠色熒光蛋白（green fl uorescent protein，eGFP）基因，進(jìn)一步構(gòu)建乳酸菌表達(dá)載體D-pLP3-PslpA-eGFP，并將其轉(zhuǎn)化至植物乳桿菌，獲得熒光蛋白的表達(dá)。該質(zhì)?？蔀槿樗峋虿僮魈峁┬碌墓ぞ撸瑸闃?gòu)建具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的乳酸桿菌的表達(dá)載體提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、植物乳桿菌LP1、植物乳桿菌LP3、鼠李糖桿菌R1、發(fā)酵乳桿菌G1、戊糖片球菌ZQ4、乳酸乳球菌NZ9000、嗜酸乳桿菌（ATCC4356）、表達(dá)載體pSCPSP均由所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存。

1.1.2 試劑

質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒、DNA純化試劑盒 美國Omega公司；預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（11～180 kDa） 中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增酶及基因克隆試劑 大連TaKaRa公司；MRS培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；其余生化及分析純?cè)噭?北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Mini-PROTEAN型蛋白電泳儀、核酸凝膠成像系統(tǒng)、TC-4000型PCR擴(kuò)增儀 美國Bio-Rad Laboratories公司；HC-3018R型高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器公司；ECLIPSE Ts2R型倒置熒光顯微鏡 日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成

質(zhì)粒pLP3、大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒D-pLP3及表達(dá)質(zhì)粒D-pLP3-PslpA的構(gòu)建過程中涉及的主要引物及其序列，引物信息見表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primer sequences used in this study

1.3.2 質(zhì)粒的分離

離心收集植物乳桿菌LP3的菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。不同于說明書的步驟是：用含有60 mg/mL溶菌酶的solution I溶液重新懸浮菌體，并在37 ℃溫育1 h，以破壞植物乳桿菌細(xì)胞壁的肽聚糖層。

1.3.3 測序載體的構(gòu)建

經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定植物乳桿菌LP3質(zhì)粒具有EcoRI酶切位點(diǎn)。對(duì)該質(zhì)粒和載體質(zhì)粒pUC57使用EcoRI進(jìn)行酶切，并將酶切產(chǎn)物用T4 DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，培養(yǎng)18 h后挑取白色菌落培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。經(jīng)PCR驗(yàn)證后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.4 質(zhì)粒序列注釋

將測序完成的DNA序列用DNAMAN（6.0）軟件進(jìn)行人工拼接，利用NCBI等國際核苷酸、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫以及DNAMAN（6.0）、SnapGene（4.0）等生物學(xué)軟件對(duì)質(zhì)粒的核苷酸及氨基酸序列進(jìn)行分析，預(yù)測質(zhì)粒的開放框。將比對(duì)完成的DNA序列進(jìn)行注釋，初步確定質(zhì)粒復(fù)制相關(guān)蛋白。再根據(jù)現(xiàn)今公布的質(zhì)粒復(fù)制蛋白（Rep）的同源性，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，推定質(zhì)粒復(fù)制方式。

1.3.5 大腸桿菌-乳酸菌穿梭載體的構(gòu)建

用引物pUC19-F/R擴(kuò)增pUC19質(zhì)粒上的大腸桿菌復(fù)制子Ori的DNA片段，在引物pUC19-F的5’端引入PshAI限制性內(nèi)切酶。引物CmR-F/R擴(kuò)增pSCPSP質(zhì)粒上的氯霉素抗性基因CmR片段，在引物CmR-R的5’端引入NheI限制性內(nèi)切酶。用融合PCR方法（SOE）將兩段DNA片段組合在一起，純化回收融合產(chǎn)物OCR。

PshAI、NheI限制性內(nèi)切酶對(duì)pLP3質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，純化回收酶切產(chǎn)物。將融合產(chǎn)物OCR和pLP3酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子酶切驗(yàn)證得到正確的重組質(zhì)粒，命名為D-pLP3。

1.3.6 乳酸菌感受態(tài)制備及電轉(zhuǎn)

參照Mason等[15]的方法制備乳酸菌感受態(tài)細(xì)胞：將10 μL的穿梭載體D-pLP3和100 μL的乳酸菌感受態(tài)細(xì)胞混勻，然后以Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)參數(shù)1.8 kV、200 Ω、25 μF[16]，脈沖時(shí)間約4.0 ms。電轉(zhuǎn)后以900 μL預(yù)冷的SMRS液重懸，冰浴20 min后，置37 ℃孵育3 h。孵育后離心，預(yù)留80 μL上清液，重懸菌體，涂布MRS平板（含25 μg/mL氯霉素），37 ℃培養(yǎng)1～2 d。

1.3.7 穿梭質(zhì)粒宿主范圍、轉(zhuǎn)化效率和穩(wěn)定性測定

取500 ng穿梭質(zhì)粒與各種乳酸菌的感受態(tài)細(xì)胞混勻，嚴(yán)格按照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化乳酸菌的方案，將穿梭質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至各種乳酸菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，待轉(zhuǎn)化子37 ℃靜置3 h活化后，涂布于含氯霉素的MRS平板上。37 ℃培養(yǎng)48～72 h，觀察MRS抗性平板是否有穿梭質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子菌落。通過計(jì)算每微克穿梭質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，測量其轉(zhuǎn)化效率。

為確定穿梭質(zhì)粒的穩(wěn)定性，采用Alvarez-Martín等[17]的方法，具體步驟如下：挑取在含氯霉素的MRS固體平板上的菌落到新鮮的含氯霉素的液體MRS培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)。按1%接種量接種到新鮮不含氯霉素的MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h。再次按1%接種量接種到新鮮的MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h，傳代培養(yǎng)直至60 代。稀釋培養(yǎng)好的菌液分別涂布含氯霉素的MRS平板和不含氯霉素的MRS的平板。根據(jù)兩平板上面的菌落數(shù)計(jì)算質(zhì)粒的穩(wěn)定性。

1.3.8 乳酸菌表達(dá)載體的構(gòu)建

PCR獲取嗜酸乳桿菌（ATCC 4356）的S層蛋白的啟動(dòng)子PslpA和信號(hào)肽Sig片段，轉(zhuǎn)錄終止子來源于質(zhì)粒pMG36e的終止子。在信號(hào)肽Sig的引物Sig-R的5'端引入MluI、ScaI、SacII三個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，構(gòu)成多克隆位點(diǎn)結(jié)構(gòu)。用SOE PCR[18]連接構(gòu)成了外源蛋白表達(dá)所需要的基本元件。為驗(yàn)證該蛋白表達(dá)體系是否能表達(dá)異源蛋白，選擇增強(qiáng)型eGFP為標(biāo)靶蛋白。

1.3.9 熒光顯微鏡觀察和蛋白SDS-PAGE鑒定

挑取轉(zhuǎn)化后的陽性重組菌D-pLP3-PslpA-eGFP和含空載體D-pLP3的植物乳桿菌LP1接種于MRS液體培養(yǎng)基（含25 μg/mL氯霉素）培養(yǎng)過夜。再將上述過夜培養(yǎng)的菌液按2%的比例接種于適量MRS培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)16 h后，取其菌體制作水浸片，用熒光顯微鏡觀察，x＝485 nm、y＝533 nm的條件下檢測樣品的熒光強(qiáng)度。37 ℃培養(yǎng)24 h后取其上清液，表達(dá)上清液中的蛋白經(jīng)60%飽和硫酸銨溶液，6 000 r/min離心10 min，所得沉淀用0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液重懸濃縮100 倍左右。加入5×蛋白上樣緩沖液，沸水中煮10 min，待蛋白充分變性冷卻至室溫，取適量上清液加至十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠加樣孔內(nèi)，進(jìn)行常規(guī)電泳。

1.4 數(shù)據(jù)圖像的處理

以Primer Premier 5.0的引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)引物的設(shè)計(jì)，以Tanon 1600全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)對(duì)DNA電泳凝膠、蛋白電泳膠圖像進(jìn)行采集及分析。以WinPlas 2.7質(zhì)粒繪圖軟件繪制質(zhì)粒的圖譜，并以MEGA 6.0構(gòu)建質(zhì)粒的系統(tǒng)發(fā)育樹。以Nikon NIS-Elements BR專業(yè)圖像分析軟件對(duì)eGFP蛋白的熒光圖像進(jìn)行采集與處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒分離和單酶切圖譜

電泳結(jié)果顯示植物乳桿菌LP3的質(zhì)粒提取液有3 條帶（圖1），提示該菌株攜帶多個(gè)質(zhì)粒。其中一個(gè)質(zhì)粒大小在2 kb左右，另外2 個(gè)質(zhì)粒大小在15 kb以上。將小質(zhì)粒（2 kb左右）進(jìn)行純化回收，并命名為pLP3。對(duì)pLP3質(zhì)粒分別采用限制性內(nèi)切酶EcoRI、XhoI、AvrII、SpeI進(jìn)行酶切分析，最終發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒經(jīng)EcoRI、XhoI、AvrII、SpeI酶切均獲得線性化質(zhì)粒，而且是唯一的線狀質(zhì)粒DNA條帶，不存在其他大小的DNA條帶（圖2）。

圖1 植物乳桿菌LP3的質(zhì)粒Fig. 1 Plasmid profile of L. plantarum LP3

圖2 質(zhì)粒pLP3酶切結(jié)果Fig. 2 Restriction enzyme analysis of pLP3

2.2 質(zhì)粒序列的驗(yàn)證

構(gòu)建的重組質(zhì)粒PUC-pLP3，在EcoRI酶切位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)引物pLP3-F/R，通過PCR驗(yàn)證所測序列是完整的（圖3）。

圖3 重組質(zhì)粒PUC-pLP3的PCR鑒定Fig. 3 Identification of PUC-pLP3 by PCR

2.3 質(zhì)粒注釋和復(fù)制方式推定

2.3.1 質(zhì)粒注釋

pLP3質(zhì)粒是雙鏈環(huán)狀DNA分子，共2 017 bp，GC含量為37.48%。BLAST比對(duì)結(jié)果顯示：該質(zhì)粒的核苷酸序列與植物乳桿菌KLDS 1.0801中的質(zhì)粒pLD1（2 112 bp，GenBank：FJ755814.1）、pC30il（2 140 bp，GenBank：J03319.1）最為相似，相似率分別為99%與98%。

通過開放閱讀框（open reading frame，ORF）搜索，pLP3有7 個(gè)ORF，ORF3編碼一個(gè)含317 個(gè)氨基酸殘基的蛋白，位于177 888～18 411 130 bp，應(yīng)為pLP3質(zhì)粒的Rep蛋白，該Rep氨基酸序列與Lactobacillus的同源性為100%，與植物乳桿菌的質(zhì)粒Rep蛋白（NCBI Reference Sequence：WP_012569251.1、WP_010889864.1、WP_010889864.1等）的同源性均為99%，317 個(gè)氨基酸中有1 個(gè)氨基酸不同。ORF5編碼一個(gè)含48 個(gè)氨基酸殘基的蛋白，位于515～661 bp，其與植物乳桿菌（NCBI Reference Sequence：WP_107724356.1）未知功能的假定蛋白相似性為100%。其余ORF在GenBank沒有與之相匹配的蛋白。目前為止，由于質(zhì)粒pLP3除具有與復(fù)制相關(guān)的蛋白外，未發(fā)現(xiàn)具有特定功能的蛋白質(zhì)，因此質(zhì)粒pLP3應(yīng)歸為隱蔽性質(zhì)粒。

ORF3編碼質(zhì)粒的Rep蛋白，在rep基因下游的10 bp處有一段反向重復(fù)序列，該序列是rep基因的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)（transcription termination signal），與pC30il質(zhì)粒rep基因的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)序列一致。通過重復(fù)序列檢索發(fā)現(xiàn)pLP3質(zhì)粒的623～768 bp有9 個(gè)重復(fù)序列，該重復(fù)序列CATGATAATG正向重復(fù)了9 次，重復(fù)序列可能和質(zhì)粒的拷貝數(shù)有關(guān)[19]。在rep基因上游的272 bp處觀察到典型的質(zhì)粒的復(fù)制雙鏈起點(diǎn)（dso），該保守序列為5’-CGG TTTCTTCTTATCTTGATACTATTAGCAACAAC-3’，與RCR質(zhì)粒pC194家族的dso同源[20]。該質(zhì)粒的復(fù)制單鏈起點(diǎn)（sso）為ssoA類型，其保守序列為TAGCGA/T[21]位于489～494 bp。

2.3.2 質(zhì)粒復(fù)制方式推定

圖4 pLP3質(zhì)粒圖譜Fig. 4 Physical map of pLP3

將比對(duì)完成的DNA序列進(jìn)行注釋，初步確定質(zhì)粒復(fù)制相關(guān)蛋白（圖4）。用植物乳桿菌質(zhì)粒復(fù)制起始相關(guān)蛋白R(shí)epA和RepB與己公布的質(zhì)粒復(fù)制相關(guān)蛋白同源性制作系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。

由植物乳桿菌質(zhì)粒復(fù)制相關(guān)蛋白同源性的系統(tǒng)進(jìn)化樹可知，推測pLP3質(zhì)粒屬于植物乳桿菌編碼Rep質(zhì)粒家族1。Rep-1蛋白家族質(zhì)粒和質(zhì)粒pC194的Rep均含有3 個(gè)保守的Motifs[22]，而且Motifs已被證明是pC194家族質(zhì)粒復(fù)制起始的關(guān)鍵[23-24]。經(jīng)過對(duì)pLP3質(zhì)粒序列分析，發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒的sso、dso位點(diǎn)以及Rep蛋白的Motifs與pC194家族的特征吻合（表2）。因此，推定pLP3的復(fù)制方式為滾環(huán)復(fù)制，屬于pC194家族。

圖5 pLP3質(zhì)粒編碼的Rep蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic tree of pLP3 encoded replication proteins

表2 pLP3質(zhì)粒Rep蛋白Motifs保守序列的比對(duì)Table 2 Alignment of protein motifs of pLP3

2.4 穿梭載體的構(gòu)建及其宿主范圍、轉(zhuǎn)化效率和穩(wěn)定性

以克隆載體pUC19為模板，用引物pUC19-F/R擴(kuò)增pUC19質(zhì)粒上的大腸桿菌復(fù)制子Ori的DNA片段。以pSCPSP質(zhì)粒為模板，用引物CmR-F/R擴(kuò)增pSCPSP質(zhì)粒上的氯霉素抗性基因CmR片段。用SOE-PCR將Ori片段與CmR片段連接構(gòu)成OCR片段，利用PshAI、NheI兩個(gè)限制性內(nèi)切酶將OCR片段融合在pLP3質(zhì)粒載體上，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子酶切驗(yàn)證得到正確的重組質(zhì)粒，命名為D-pLP3。

表3 穿梭質(zhì)粒D-pLP3在不同乳酸菌宿主中的轉(zhuǎn)化效率和穩(wěn)定性Table 3 Transformation ef fi ciency and stability of shuttle vector D-pLP3 in different hosts

為確定穿梭質(zhì)粒D-pLP3的宿主范圍，將穿梭質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至各種乳酸菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，并計(jì)算其在各種乳酸菌的轉(zhuǎn)化效率和質(zhì)粒的穩(wěn)定性。表3表明：穿梭質(zhì)粒D-pLP3均可在植物乳桿菌LP1和LP3、鼠李糖桿菌R1等乳酸桿菌和乳酸乳球菌NZ9000內(nèi)成功電轉(zhuǎn)，獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)化子。但在發(fā)酵乳桿菌G1、戊糖片球菌ZQ4未能獲得重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率介于0.3h102～1.0h103CFU/μg（DNA質(zhì)量計(jì)）之間，比普通的乳酸菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率略低。

重組質(zhì)粒在植物乳桿菌LP1、LP3的宿主菌的丟失率約為30%，在乳酸乳球菌NZ9000中丟失率為37%。重組質(zhì)粒在鼠李糖桿菌R1中經(jīng)過60 代連續(xù)傳代培養(yǎng)后，重組質(zhì)粒丟失率幾乎達(dá)到100%。重組質(zhì)粒D-pLP3在不同乳酸菌感受態(tài)細(xì)胞電轉(zhuǎn)化效率和質(zhì)粒穩(wěn)定性的差異，可能與質(zhì)粒不相容性有關(guān)。

2.5 表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建和熒光蛋白檢測結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3 對(duì)引物分別PCR擴(kuò)增嗜酸乳桿菌S層蛋白的slpA啟動(dòng)子、Sig信號(hào)肽、pMG36e上的轉(zhuǎn)錄終止子，根據(jù)SOE-PCR的原理將3 個(gè)外源基因表達(dá)原件，克隆至穿梭質(zhì)粒D-pLP3，成功構(gòu)建乳酸菌表達(dá)質(zhì)粒D-pLP3-PslpA（圖6）。依據(jù)eGFP蛋白能在藍(lán)光的激發(fā)下顯示綠色熒光的特性，因此，選eGFP蛋白作為表達(dá)質(zhì)粒的靶標(biāo)蛋白。

圖6 構(gòu)建穿梭質(zhì)粒D-pLP3和表達(dá)質(zhì)粒D-pLP3-PslpA的流程圖Fig. 6 Schematic illustration of construction of shuttle vector D-pLP3 and expression vector D-pLP3-PslpA

重組質(zhì)粒D-pLP3-PslpA-eGFP電轉(zhuǎn)至植物乳桿菌，挑取轉(zhuǎn)化后的陽性重組菌D-pLP3-PslpA-eGFP-LP1和空載體D-pLP3-LP1接種于MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，先取16 h重組植物乳桿菌的菌體進(jìn)行熒光顯微鏡觀察，在藍(lán)光激發(fā)下，可以觀察到綠色熒光（圖7）。然后取24 h重組植物乳桿菌的表達(dá)上清液，經(jīng)60%硫酸銨沉淀后100 倍濃縮，SDS-PAGE分析。與空載體D-pLP3-LP1的重組菌相比較，重組菌D-pLP3-PslpA-eGFP-LP1的培養(yǎng)上清液可見27 kDa左右的目的條帶（圖8）。說明重組菌D-pLP3-PslpA-eGFP-LP1已成功電轉(zhuǎn)至植物乳桿菌LP1中，信號(hào)肽Sig能夠?qū)GFP蛋白成功分泌到胞外。

圖7 重組植物乳桿菌eGFP蛋白的顯微鏡觀察（×100）Fig. 7 GFP expression in recombinant L. plantarum (× 100)

圖8 重組植物乳桿菌eGFP蛋白的SDS-PAGE鑒定Fig. 8 SDS-PAGE detection of eGFP from recombinant L. plantarum

3 討 論

植物乳桿菌益生菌在自然界分布廣泛，對(duì)多種不同的環(huán)境具有高度的適應(yīng)性[25]，可能由于植物乳桿菌具有較大的基因組和攜帶豐富多樣的質(zhì)粒有關(guān)。植物乳桿菌通常含有幾個(gè)質(zhì)粒，大小介于2～68 kb之間，植物乳桿菌質(zhì)粒使其具有某些特殊的功能，如糖、氨基酸及檸檬酸代謝；重金屬、抗生素等抗性；細(xì)菌素產(chǎn)生與分泌等[26]。隨著分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的不斷突破，利用植物乳桿菌的隱蔽性質(zhì)粒構(gòu)建乳酸菌質(zhì)粒載體是其基因改造的研究熱點(diǎn)。

本研究從分離自傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜中的植物乳桿菌LP3中得到一個(gè)天然質(zhì)粒pLP3，該質(zhì)粒大小為2 017 bp，GC含量為37.48%。進(jìn)一步通過生物信息學(xué)分析質(zhì)粒pLP3，該質(zhì)粒編碼7 個(gè)ORF，其中ORF3（317 個(gè)氨基酸）為復(fù)制起始蛋白（RepA），ORF5（48 個(gè)氨基酸）編碼一個(gè)未知功能的蛋白。其余ORF在GenBank沒有與之相匹配的蛋白，因此質(zhì)粒pLP3應(yīng)歸為隱蔽性質(zhì)粒。根據(jù)Rep蛋白的同源性，及其該質(zhì)粒的sso、dso位點(diǎn)以及Rep蛋白的Motifs與pC194家族進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)與pC194家族的特征相吻合，推測該質(zhì)粒的復(fù)制方式為滾環(huán)復(fù)制，屬于pC194家族。乳桿菌RC型復(fù)制質(zhì)粒因具有寬宿主性質(zhì)，而得到較廣泛地應(yīng)用[27]，由于pLP3質(zhì)粒為RC型復(fù)制質(zhì)粒，因此該質(zhì)粒具有寬宿主性質(zhì)，能在不同類型的乳酸菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。質(zhì)粒pLP3來自食品級(jí)的乳酸菌，質(zhì)粒本身較小，RC型復(fù)制質(zhì)粒寬宿主性質(zhì)，這些特性利于其構(gòu)建為適宜的乳酸菌工程載體。

以質(zhì)粒pLP3為載體，同時(shí)分別以克隆載體pUC19和植物乳桿菌表達(dá)載pSCPSP為模板，PCR分別擴(kuò)增得到大腸桿菌的復(fù)制子和氯霉素抗性基因，將兩個(gè)基因片段整合至pLP3質(zhì)粒上，成功構(gòu)建大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒D-pLP3。將穿梭質(zhì)粒D-pLP3電轉(zhuǎn)至不同的乳酸菌感受態(tài)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒均能在乳酸乳球菌和乳酸桿菌內(nèi)復(fù)制。通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率和質(zhì)粒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的效率介于0.3h102～1.0h103CFU/μg之間，乳酸菌質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化效率一般在10～105CFU/μg左右[28]。穿梭質(zhì)粒比普通的乳酸菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率略低，可能的原因有：其一，宿主菌株存在的限制修飾系統(tǒng)和CRISPR機(jī)制，對(duì)未甲基化的外源質(zhì)粒直接排斥。其二，宿主菌株內(nèi)可能存在同一不親和群的質(zhì)粒[10]。其三，限制轉(zhuǎn)化效率的原因如電壓、緩沖液、不同宿主的DNA甲基化水平、感受態(tài)細(xì)胞狀態(tài)等。影響穿梭質(zhì)粒D-pLP3穩(wěn)定性的原因可能是RC型質(zhì)粒及其衍生載體在復(fù)制過程中產(chǎn)生單鏈DNA中間體，容易發(fā)生質(zhì)?；虻闹亟M和損傷，進(jìn)而引起質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)和遺傳穩(wěn)定性降低。而且滾環(huán)復(fù)制型質(zhì)粒插入外源DNA片段過大，也會(huì)導(dǎo)致其衍生載體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低。該穿梭質(zhì)粒經(jīng)過60 代無抗性連續(xù)傳代培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)相比其他乳酸菌而言，穿梭質(zhì)粒D-pLP3在植物乳桿菌的轉(zhuǎn)化效率最高、質(zhì)粒丟失率最低，這可能和質(zhì)粒的不相容性有關(guān)[11]。

乳桿菌S層蛋白啟動(dòng)子PslpA、Usp45和乳糖脫氫酶啟動(dòng)子Pldh等均能在乳酸菌宿主中用于異源蛋白的表達(dá)[10,29-30]。在穿梭質(zhì)粒D-pLP3的基礎(chǔ)上加上啟動(dòng)子PslpA和eGFP基因，進(jìn)一步構(gòu)建乳酸菌表達(dá)載體D-pLP3-PslpA-eGFP，并用其轉(zhuǎn)化至植物乳桿菌，成功獲得了熒光蛋白的表達(dá)。將重組乳酸菌培養(yǎng)的上清液進(jìn)行SDS-PAGE檢測，在27 kDa左右觀察到目的蛋白條帶，表明S層蛋白的信號(hào)肽Sig能夠?qū)GFP蛋白成功分泌到胞外。乳酸菌外源蛋白的分泌表達(dá)，為乳酸菌口服疫苗的制備提供了有力的論據(jù)。雖然該表達(dá)載體的抗性篩選基因?qū)|(zhì)粒載體改造方面具有推動(dòng)作用，但在食品、疫苗等生產(chǎn)方面的應(yīng)用受到一定程度的限制。選擇食品級(jí)的篩選標(biāo)記，構(gòu)建食品級(jí)乳酸菌載體是接下來研究工作的重點(diǎn)。

測得植物乳桿菌LP3內(nèi)源性質(zhì)粒pLP3的全序列，該質(zhì)粒全長為2 017 bp，復(fù)制方式為滾環(huán)復(fù)制，屬于pC194家族。基于質(zhì)粒pLP3的復(fù)制子，構(gòu)建了大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒D-pLP3，且具有寬宿主性質(zhì)，質(zhì)粒丟失率低。同時(shí)，表達(dá)載體D-pLP3-PslpA有潛力作為乳酸菌研究的重要工程載體和黏膜疫苗表達(dá)工具，具有良好的應(yīng)用前景。