（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品與生物工程系，北京 102442）

奶酒是蒙古族人的主要飲料之一，又稱為“蒙古酒”，奶酒綿厚醇香，無(wú)色透明，少飲延年健體、活血補(bǔ)氣，男女老幼皆可飲之[1]。但傳統(tǒng)的奶酒釀制工藝繁雜，風(fēng)味不穩(wěn)定，為此，翁鴻珍等[2]對(duì)奶酒的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，扈麟等[3]以鮮牛乳和糯米為主要原料研制出了一種新型奶酒。朱俊杰等以牛乳和核桃為主要原料，將核桃經(jīng)粉碎、磨漿、脫脂、調(diào)配等工序處理后，用所得核桃粉以10%的體積分?jǐn)?shù)加入新鮮牛乳中，接種乳酸菌和酵母菌為發(fā)酵劑，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝，最終釀出的核桃奶酒最佳工藝參數(shù)為乳酸菌和酵母菌的比例為1∶3，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵初始pH值4.5，發(fā)酵時(shí)間8d。在此條件下所得產(chǎn)品香味突出，口味獨(dú)特。近年來(lái)，隨著人們對(duì)健康飲食的關(guān)注度越來(lái)越高，富含酚類(lèi)物質(zhì)的葡萄受到廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。葡萄中的酚類(lèi)物質(zhì)主要包括黃酮醇、黃烷醇、酚酸和花色苷等，與葡萄的抗氧化活性相關(guān)[4]，并且有助于人體細(xì)胞和組織對(duì)抗自由基[5]，保護(hù)血管和血小板，平衡膽固醇[6]，調(diào)節(jié)血壓、血脂[7]，提高抗氧化、抗炎癥和抗內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的能力。經(jīng)常食用葡萄可以減小患心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病和癌癥等慢性病的幾率[8]。此外，葡萄汁味美可口，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，含有糖類(lèi)、有機(jī)酸、礦物質(zhì)、維生素、氨基酸、蛋白質(zhì)、粗纖維、卵磷脂等[9]多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。本研究在前期奶酒研發(fā)的基礎(chǔ)上，主要利用乳酸菌發(fā)酵劑和釀酒酵母的共同作用，以葡萄汁和鮮牛奶為原料，開(kāi)發(fā)一款新型的低醇葡萄汁奶酒，為加快這一發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)提供借鑒。

1 材料與設(shè)備

1．1 材料與試劑

牛奶、葡萄汁：市售；乳酸菌、酵母菌和曲霉菌菌種：食品安全檢測(cè)中心保存；麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基、麥芽汁液體培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基等，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1．2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)，上海錦屏儀器儀表有限公司產(chǎn)品；恒溫?fù)u床，江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠產(chǎn)品；氨基酸分析儀，上海輝世儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；立式高壓蒸汽滅菌鍋， 上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司產(chǎn)品。

2 試驗(yàn)方法

2．1 工藝流程

2．2 操作要點(diǎn)

（1）原料處理：選用新鮮、無(wú)蟲(chóng)害、無(wú)霉?fàn)€變質(zhì)的葡萄，清洗后榨汁過(guò)濾，貯于4℃冰箱備用。

（2）調(diào)配：純牛奶、葡萄汁和白砂糖按一定比例進(jìn)行調(diào)配。

（3）菌種的活化：將在甘油中保藏的乳酸菌、酵母菌和曲霉菌種，加入到對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基中進(jìn)行活化。然后離心去掉上清液后，用無(wú)菌水沖洗后離心去掉上清液，重復(fù)3次后備用。

（4）發(fā)酵：將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的葡萄汁牛奶分裝在容量為500mL的瓶中，裝液量為200mL，接入酵母菌、乳酸菌和曲霉菌，先進(jìn)行單因素試驗(yàn)后再進(jìn)行正交試驗(yàn)。接種后放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置發(fā)酵。

2．3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 葡萄汁奶酒的基礎(chǔ)配方和工藝

接種量（酵母菌∶曲霉菌∶乳酸菌）為1.0%∶0.5%∶1.5%，蔗糖添加量為7%，葡萄汁添加量為6%，全脂牛奶的添加量為84%，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間為3d。

2.3.2 單因素的篩選

在基礎(chǔ)配方和工藝的情況下，每次變化1個(gè)因素，而其他因素不變，通過(guò)感官評(píng)分的方式篩選出最優(yōu)的因素水平。分別選取接菌比例（酵母菌∶曲霉菌∶乳酸菌）為①0.33%∶0.17%∶2.5%、②0.66%∶0.34%∶2.0%、③1.0%∶0.5%∶1.5%、④1.32%∶0.68%∶1.0%、⑤1.67%∶0.83%∶0.5%、⑥2%∶1%∶0%；發(fā)酵溫度為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃；蔗糖添加量為3%、5%、7%、9%、11%、13%；發(fā)酵時(shí)間為1d、3d、5d、7d、9d、11d；葡萄汁添加量為1%、3%、6%、9%、12%、15%進(jìn)行單因素發(fā)酵試驗(yàn)，并通過(guò)感官評(píng)分確定正交試驗(yàn)因子的水平。

2．4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)影響葡萄汁奶酒質(zhì)量的5個(gè)因素：發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、接種量（C）、蔗糖添加量（D）、葡萄汁添加量（E）進(jìn)行5因子4水平正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因子水平如表1所示。

表1 試驗(yàn)及因子水平

2．5 感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成，邀請(qǐng)10名經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的人員組成評(píng)定小組，明確感官評(píng)價(jià)的指標(biāo)和注意事項(xiàng)。感官評(píng)定的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)成品的色澤（25分）、口感（30分）、香味（25分）、組織狀態(tài)（20分）進(jìn)行綜合評(píng)分，滿分100分。葡萄汁奶酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表2 葡萄汁奶酒感官評(píng)價(jià)細(xì)則

2．6 理化指標(biāo)的檢測(cè)

2.6.1 總糖的測(cè)定

總糖（以葡萄糖計(jì)）的測(cè)定采用斐林試劑法[10]。

2.6.2 酒精體積分?jǐn)?shù)的測(cè)定

酒精體積分?jǐn)?shù)的測(cè)定采用密度瓶法[10]。

2.6.3 總酸的測(cè)定

總酸的測(cè)定采用電位滴定法[10]。

2.6.4 氨基酸態(tài)氮的測(cè)定

奶酒中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定參考《GB/T 5009.39-2003，中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 釀造醬油》進(jìn)行測(cè)定[11]。

2．7 氨基酸成分的檢測(cè)

奶酒中氨基酸成分的檢測(cè)參考《GB 5009.124-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》[12]測(cè)定。

2．8 奶酒貯藏期間品質(zhì)的評(píng)價(jià)

2.8.1 菌落總數(shù)的測(cè)定

奶酒貯藏期間菌落總數(shù)的測(cè)定根據(jù)《GB 4789.2-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[13]的方法進(jìn)行檢測(cè)。

2.8.2 感官評(píng)價(jià)

奶酒貯藏期間感官評(píng)價(jià)依照2.5的方法進(jìn)行。

3 結(jié)果與分析

3．1 單因素試驗(yàn)感官評(píng)價(jià)結(jié)果

3.1.1 接種量對(duì)葡萄汁奶酒感官評(píng)價(jià)的影響

圖1 接種量對(duì)葡萄汁奶酒感官評(píng)分的影響

由圖1可以看出，隨著酵母菌和霉菌接種比例的不斷增加，葡萄汁奶酒的感官評(píng)分也隨之不斷增加。當(dāng)接種比例為1.0%∶0.5%∶1.5%時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最高分，并顯著高于其他各組（P＜0.05）。酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中將可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)化為二氧化碳和乙醇，同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生其他一些醇、醛、酸、酯等香味物質(zhì)[14]。當(dāng)酵母菌和霉菌接種量偏低時(shí)，容易使得釀酒原料不能完全發(fā)酵，造成葡萄汁奶酒酒精度偏低，酒香不突出等。但如果乳酸菌的接種量較低時(shí)，特有的酸味又減弱了，感官評(píng)分也不高。因此，選擇編號(hào)為2、3、4、5的接種比例進(jìn)行正交試驗(yàn)。

3.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)葡萄汁奶酒感官評(píng)價(jià)的影響

由圖2可以看出，隨著發(fā)酵溫度的提高，葡萄汁奶酒的感官評(píng)分也隨之不斷提高，當(dāng)發(fā)酵溫度達(dá)到30℃時(shí)感官評(píng)分達(dá)到峰值，但與發(fā)酵溫度為25℃時(shí)的感官評(píng)分差異不顯著（P＞0.05），然后開(kāi)始下降。顯然高溫不利于酵母菌和霉菌的生長(zhǎng)繁殖。因此，選擇發(fā)酵溫度為20、25、30、35℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)葡萄汁奶酒感官評(píng)分的影響

3.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)葡萄汁奶酒感官評(píng)價(jià)的影響

由圖3可以看出，葡萄汁奶酒的感官評(píng)分隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為5d時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最高，并顯著高于其他各個(gè)發(fā)酵時(shí)間（P＜0.05）。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)葡萄汁奶酒感官評(píng)分的影響

3.1.4 蔗糖添加量對(duì)葡萄汁奶酒感官評(píng)價(jià)的影響

由圖4可以看出，葡萄汁奶酒的感官評(píng)分隨著蔗糖添加量的增加而增加，當(dāng)蔗糖添加量為9%時(shí)最高，與7%的添加量差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于其他各個(gè)發(fā)酵時(shí)間（P＜0.05）。隨著蔗糖添加量的繼續(xù)增加，感官評(píng)分開(kāi)始呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，可能是由于過(guò)多的糖會(huì)被發(fā)酵菌株轉(zhuǎn)化為酸類(lèi)、酯類(lèi)和醛類(lèi)等物質(zhì)導(dǎo)致的[15]。

圖4 蔗糖添加量對(duì)葡萄汁奶酒感官評(píng)分的影響

3.1.5 葡萄汁添加量對(duì)葡萄汁奶酒感官評(píng)價(jià)的影響

由圖5可以看出，葡萄汁奶酒的感官評(píng)分隨著葡萄汁添加量的增加而增加，當(dāng)添加量為9%時(shí)最高，并顯著高于其他各個(gè)發(fā)酵時(shí)間（P＜0.05）。

圖5 葡萄汁添加量對(duì)葡萄汁奶酒感官評(píng)分的影響

3．2 正交試驗(yàn)感官評(píng)價(jià)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)正交試驗(yàn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，通過(guò)SPSS 20.0軟件設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，對(duì)接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、蔗糖添加量和葡萄汁添加量5個(gè)因素分析得到以下試驗(yàn)方案及結(jié)果（表3）：5個(gè)因素對(duì)葡萄汁奶酒感官評(píng)分影響的強(qiáng)弱順序依次為：發(fā)酵溫度＞接種量＞發(fā)酵時(shí)間＞蔗糖添加量＞葡萄汁添加量。通過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)A2B2C2D2E4組合最佳，即發(fā)酵溫度為25℃，發(fā)酵時(shí)間為5d，接種量為1.00%∶0.50%∶1.50%，蔗糖添加量為8%，葡萄汁添加量為11%。因?yàn)樵摻M合不在正交試驗(yàn)序列里，因此進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明該組合釀制的葡萄汁奶酒感官評(píng)分評(píng)分最高，為92分。

3．3 理化指標(biāo)分析結(jié)果

經(jīng)測(cè)得，葡萄汁奶酒在最佳發(fā)酵工藝條件下的總糖為9.5g/L，酒精體積分?jǐn)?shù)為6.8%，總酸質(zhì)量濃度為7.2g/L，氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度為0.21g/L，4種理化指標(biāo)均符合GB/T 2354-2009的標(biāo)準(zhǔn)。

3．4 氨基酸數(shù)據(jù)分析結(jié)果

由圖6可以看出，通過(guò)比較葡萄汁奶酒、奶酒和牛奶的氨基酸含量可以發(fā)現(xiàn)，葡萄汁奶酒中的天門(mén)冬氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸和脯氨酸含量顯著高于奶酒和牛奶中的含量（P＜0.05），但是蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、纈氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸和精氨酸的含量與奶酒和牛奶的含量差異不顯著（P＞0.05）。

圖6 發(fā)酵前后氨基酸含量的比較

3．5 葡萄汁奶酒貯藏品質(zhì)變化

如表4所示，葡萄汁奶酒在貯藏期間的菌落總數(shù)隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，達(dá)到6個(gè)月時(shí)已經(jīng)超過(guò)GB/T 2354-2009中的相關(guān)規(guī)定。感官評(píng)分則隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷下降。因此，在現(xiàn)有條件下，葡萄汁奶酒的保質(zhì)期不能超過(guò)6個(gè)月。

表4 葡萄汁奶酒在常溫保存中的菌落總數(shù)和感官評(píng)分變化

4 結(jié)論

影響葡萄汁奶酒感官評(píng)分因素的強(qiáng)弱順序依次為：發(fā)酵溫度＞接種量＞發(fā)酵時(shí)間＞蔗糖添加量＞葡萄汁添加量，通過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)A2B2C2D2E4組合最佳，即發(fā)酵溫度為25℃，發(fā)酵時(shí)間為5d，接種量為1.00%∶0.50%∶1.50%，蔗糖添加量為8%，葡萄汁添加量為11%。該組合釀制的葡萄汁奶酒感官評(píng)分最高，為92分。經(jīng)測(cè)得，葡萄汁奶酒在最佳發(fā)酵工藝條件下的總糖為9.5g/L，酒精體積分?jǐn)?shù)為6.8%，總酸質(zhì)量濃度為7.2g/L，氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度為0.21g/L，4種理化指標(biāo)均符合GB/T 2354-2009的標(biāo)準(zhǔn)。該葡萄汁奶酒中的天門(mén)冬氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸和脯氨酸含量顯著高于奶酒和牛奶中的含量（p＜0.05）。在現(xiàn)有條件下，該葡萄汁奶酒的保質(zhì)期不超過(guò)6個(gè)月。