李英彬 孫圣榮

乳腺癌(BC)是女性最常見的惡性腫瘤[1]，其發(fā)生機(jī)制不明。水通道蛋白(aquaporin，AQP)家族是一種疏水性跨膜蛋白，大小為26～34 kDa，廣泛地存在于包括哺乳動(dòng)物在內(nèi)的多種生物中[2]。目前，在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少13種AQP亞型[3]。Aquaporin 4(AQP4)是AQP家族的一員，在維持水和離子平衡中起關(guān)鍵作用。有研究發(fā)現(xiàn)，AQP4在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[4]。敲除AQP4能抑制成年小鼠腦室下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，遷移和神經(jīng)分化[5]。Shi等[6]篩選在乳腺癌組織中的AQP的表達(dá)譜時(shí)發(fā)現(xiàn)，AQP4在腫瘤組織中的表達(dá)水平顯著高于正常組織，這說明它在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中可能起一定的作用。本研究擬研究AQP4的表達(dá)水平及其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

對(duì)象與方法

一、材料

人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，T47D，MCF-7 和 ER-ZR-70均購買于中國科學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)研究所(上海)。

二、方法

1.小干擾RNA(siRNA)處理：T47D 和MCF-7細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，將siRNA和Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)分別與Opti-MEM無血清培養(yǎng)基混合，再將二者混合后處理腫瘤細(xì)胞，6小時(shí)后更換為正常培養(yǎng)基。

2.RNA的分離和實(shí)時(shí)PCR鑒定：總RNA使用RNeasy 試劑盒進(jìn)行提取。使用PrimeScript RT-PCR試劑盒對(duì)1 μg的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(Takara Bio，Tepco，Japan)，通過PCR檢測(cè)AQP4mRNA的表達(dá)(引物：5′-GCTCAATAGCTTTAGCAATTG-3′，吉?jiǎng)P基因公司合成， 上海)。

3.蛋白免疫印跡：細(xì)胞樣品使用1×RIPA細(xì)胞裂解液進(jìn)行蛋白裂解，超聲波破碎，離心得上清，100℃煮樣10分鐘，SDS-PAGE膠分離蛋白，特異性抗體孵育(抗-AQP4：SantaCruzBiotechnology sc-20812，SantaCruz，CA，1：1000；抗-β-actin：SantaCruzBiotechnology sc1616，SantaCruz，CA，1：1000)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Odyssey?Imager 軟件(LI-COR，Lincoln，NE，USA)對(duì)條帶的熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，以β-action條帶的相對(duì)熒光強(qiáng)度值作為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析對(duì)照。

4.劃痕試驗(yàn)：人乳腺癌細(xì)胞在含有1%胎牛血清的培養(yǎng)基中饑餓處理24小時(shí)，之后使用標(biāo)準(zhǔn)的200 μl 無菌槍頭對(duì)細(xì)胞爬片進(jìn)行劃線。細(xì)胞劃痕的愈合情況由光鏡下檢測(cè)到的細(xì)胞生長(zhǎng)遷移距離來進(jìn)行評(píng)估。

5.腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)根據(jù)細(xì)胞穿透Transwell小室(Costar，Cambridge，MA，USA)基質(zhì)膠的程度來進(jìn)行評(píng)估。在光鏡下計(jì)數(shù)預(yù)先設(shè)立的5個(gè)區(qū)域內(nèi)穿過基質(zhì)膠的腫瘤細(xì)胞的數(shù)目。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1.AQP4在人乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)特性：首先通過Western Blot試驗(yàn)驗(yàn)證AQP4在人乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)，以β-actin作為對(duì)照(圖1)。

AQP4在T47D和MCF-7細(xì)胞系中的表達(dá)高于MDA-MB-231和ER-ZR-70。因此，我們選擇 T47D 和MCF-7 細(xì)胞系做進(jìn)一步研究。利用siRNA技術(shù)沉默T47D和MCF-7細(xì)胞中AQP4 mRNA的表達(dá)，通過RT-PCR分析和免疫印跡分析檢測(cè)AQP4的表達(dá)(圖2)。以無序的核苷酸序列同樣轉(zhuǎn)染入細(xì)胞株內(nèi)作為(siCtrl)陰性對(duì)照，AQP4mRNA相對(duì)表達(dá)量，siAQP4/MCF-7組和siAQP4/T47D組均比對(duì)照siCtrl組低(P<0.01)。以β-actin蛋白為內(nèi)參，AQP4蛋白的表達(dá)水平，siAQP4/MCF-7組和siAQP4/T47D組均比空白對(duì)照siCtrl組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明經(jīng)過siRNA沉默后，AQP4 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯減少。

圖1 Western Blot檢測(cè)不同乳腺癌細(xì)胞系中AQP4的表達(dá)情況

2.沉默AQP4顯著降低乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力：AQP4敲除的乳腺癌細(xì)胞系中，劃痕愈合所需的時(shí)間明顯比相應(yīng)的對(duì)照組更長(zhǎng)。敲除AQP4顯著降低了乳腺癌細(xì)胞的遷移能力(圖3)。遷移結(jié)果在0小時(shí)siAQP4/T47D及siAQP4/MCF-7組與siCtrl組無明顯差異， 24小時(shí)內(nèi)siCtrl組組內(nèi)對(duì)比細(xì)胞愈合率明顯上升，說明細(xì)胞遷移距離增加，24小時(shí)內(nèi)siAQP4/T47D及siAQP4/MCF-7組組內(nèi)對(duì)比細(xì)胞愈合率上升相對(duì)緩慢。但同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞愈合率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，siAQP4組劃痕愈合能力明顯受到抑制，表現(xiàn)為劃痕愈合面積縮小，劃痕愈合面積內(nèi)細(xì)胞遷移數(shù)量明顯下降(圖3)。細(xì)胞愈合率siAQP4/T47D組和siAQP4/MCF-7組低于siCtrl組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明經(jīng)轉(zhuǎn)染后沉默AQP4的T47D和MCF-7細(xì)胞的遷移能力下降。

將siAQP4 T47D、 siAQP4MCF-7組細(xì)胞及未處理細(xì)胞和對(duì)照組(siCrtl)細(xì)胞分別接種于Matrigel膠鋪就的Transwell小室中，48小時(shí)后固定染色。

侵襲實(shí)驗(yàn)顯示 siAQP4細(xì)胞和siCtrl細(xì)胞在侵襲能力上有明顯差異(P<0.05)(圖4)。細(xì)胞定量分析表明siCtrl組穿過的細(xì)胞數(shù)目較siAQP/T47D 組高2.3倍(P<0.05)，較siAQP/MCF細(xì)胞高 2.0倍(P<0.05)。結(jié)果表明siAQP4組乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力明顯降低，說明AQP4蛋白對(duì)乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力有重要作用。

圖4 Transwell小室實(shí)驗(yàn)

討 論

遷移是細(xì)胞基本特性，這一過程出現(xiàn)在損傷后組織修復(fù)、炎癥反應(yīng)、新生血管形成和腫瘤擴(kuò)散等生理和病理過程中[7]。細(xì)胞遷移能力降低通常會(huì)導(dǎo)致侵襲能力的下降[8]。根據(jù)對(duì)培養(yǎng)中遷移細(xì)胞的觀察，將細(xì)胞遷移分為四個(gè)過程：極化、突起、牽拉和收縮[9]。其中，質(zhì)膜突起由肌動(dòng)蛋白重組構(gòu)成偽足結(jié)構(gòu)為細(xì)胞遷移提供基礎(chǔ)，水在細(xì)胞內(nèi)外的流動(dòng)為細(xì)胞遷移提供動(dòng)力[10]。有研究顯示，AQP作為一種肌動(dòng)蛋白，其聚合/解聚引起跨膜離子流結(jié)果導(dǎo)致靠近前緣處的遷移細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)滲透壓的快速變化，促進(jìn)滲透水流穿過質(zhì)膜滲入細(xì)胞突起，導(dǎo)致細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)[11]。在水通道的調(diào)節(jié)中，磷酸化是一個(gè)很重要的過程，從機(jī)制上來看，AQP4含有PKA和PKC磷酸化的同源序列，這些水通道受磷酸化作用直接調(diào)節(jié)，并認(rèn)為磷酸化與AQP的運(yùn)輸、門控以及重新分布有關(guān)，可見磷酸化直接影響其功能[12]。

腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是在多基因協(xié)同作用下，癌細(xì)胞通過與宿主細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)等多因素之間相互作用及信號(hào)整合的結(jié)果。在侵襲轉(zhuǎn)移過程中腫瘤細(xì)胞的黏附、分泌蛋白酶、運(yùn)動(dòng)三種行為互相協(xié)調(diào)，在不同的時(shí)間和空間進(jìn)行著精細(xì)的調(diào)控[13]。在腫瘤的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散中，癌細(xì)胞與癌細(xì)胞黏附和解離起著決定的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞在原發(fā)灶脫落、侵入轉(zhuǎn)移位點(diǎn)并增殖的一系列過程中所涉及的細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)間的相互作用由特異性黏附分子介導(dǎo)的[14]。

乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲可能與AQP磷酸化介導(dǎo)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)有關(guān)，在此基礎(chǔ)上腫瘤細(xì)胞間黏附力的降低可能促進(jìn)這一過程。這種生物學(xué)行為信號(hào)傳導(dǎo)的研究是一個(gè)廣泛而復(fù)雜的過程。有研究顯示，替莫唑胺通過下調(diào)AQP4的表達(dá)以及激活MAPK信號(hào)通路，進(jìn)而降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移及轉(zhuǎn)移能力[15]。胡慧等[16]研究STAT3通路通過介導(dǎo)MMP-2和MMP-9的表達(dá)抑制乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。AQP在乳腺癌中作用通路研究較少，測(cè)試何種機(jī)制介導(dǎo)AQP在這些過程中的作用也是本實(shí)驗(yàn)未來研究重點(diǎn)。完整的通路研究有利于開發(fā)AQP4成為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。