■林 淼 陳志遠(yuǎn) 鞏 帥 封麗梅 王闊鵬 胡梓軒

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009）

硝酸鹽是一種非蛋白氮類型，在瘤胃中可被微生物還原，以亞硝酸鹽為中間產(chǎn)物最終生成氨，并再次被微生物利用，合成菌體蛋白[1]。因此，目前認(rèn)為瘤胃微生物是調(diào)控硝酸鹽還原的主要原因。林淼等[2]的體外培養(yǎng)試驗(yàn)表明，瘤胃細(xì)菌和原蟲是主要的硝酸鹽還原微生物，而真菌對(duì)其的還原能力忽略不計(jì)。目前報(bào)道的硝酸鹽還原菌主要包括反芻獸新月單胞菌（Selenomonas ruminantium）、小韋榮氏球菌（Veillonella parvula）、產(chǎn)琥珀酸沃廉菌（Wolinella succinogenes）、產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌（Mannheimia succiniciproducens）、胎兒彎曲桿菌（Campylobacter fetus），其中反芻獸新月單胞菌的數(shù)量最多[3-5]。Zhou等[6]體外培養(yǎng)研究表明，添加5 mM 硝酸鹽降低了產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌，瘤胃白色球菌和瘤胃黃色球菌的豐度，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)、瘤胃白色球菌和瘤胃黃色球菌的數(shù)量增加，說(shuō)明瘤胃內(nèi)的某些細(xì)菌能夠適應(yīng)硝酸鹽。Zhao等[7]在肉牛日糧中添加2%硝酸鹽（干物質(zhì)基礎(chǔ)）增加了反芻獸新月單胞菌、產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌和胎兒彎曲桿菌的相對(duì)豐度。目前硝酸鹽對(duì)湖羊瘤胃微生物區(qū)系影響的研究較少。本試驗(yàn)在湖羊日糧中添加不同劑量的硝酸鉀，采集瘤胃液進(jìn)行16S rDNA 測(cè)序分析，研究硝酸鹽對(duì)瘤胃細(xì)菌的影響，對(duì)明確硝酸鹽在瘤胃內(nèi)的微生物還原機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取3頭9月齡，體重相近（30±5）kg且裝有永久性瘤胃瘺管的健康湖羊，日糧配方參照參照NRC（2007）的成年羊的營(yíng)養(yǎng)需要，具體營(yíng)養(yǎng)成分見表1。以不添加硝酸鉀為對(duì)照（A），逐量增加硝酸鉀的添加量至6（B）、12（C）、18（D）、24（E）、30（F）g/d。每個(gè)添加梯度設(shè)置14 d 預(yù)試期，2 d 采樣期。試驗(yàn)羊每天飼喂兩次（9:00和16:00），自由飲水，保持羊舍適宜的光照和通風(fēng)，定期消毒。

表1 基礎(chǔ)日糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 方法

1.2.1 樣品采集和DNA提取

采集晨飼后2 h的瘤胃內(nèi)容物，以4層紗布過(guò)濾，立即帶回實(shí)驗(yàn)室，使用糞便基因組提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）提取總DNA，用微量核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定DNA 濃度，并以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取效果，于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 高通量測(cè)序

用無(wú)菌超純水稀釋DNA 樣品濃度至1 ng/μl，使用帶Barcode 的引物序列515F 5’GTGCCAGCMGCCGCGGTAA 3’，806R 5’GGACTACHVGGGTWTCTAAT 3’擴(kuò)增16S V4區(qū)，根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等濃度混樣。使用New England Biolabs 公司的NEB Next?Ultra?DNA Library Prep Kit for Illumina 建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，再經(jīng)Qubit定量和文庫(kù)檢測(cè)合格后，在Illumina MiSeq 平臺(tái)上進(jìn)行雙末端測(cè)序（諾禾致源生物信息科技公司，北京）。

Illumina Miseq 雙末端測(cè)序結(jié)束后，根據(jù)Barcode序列將拆分下機(jī)數(shù)據(jù)，并截去Barcode 序列和PCR 擴(kuò)增引物序列。將拆分的數(shù)據(jù)使用FLASH (V1.2.7,http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)對(duì)每個(gè)樣品的reads 進(jìn)行拼接，得到有效序列。將有效序列進(jìn)行去雜過(guò)濾掉，其中連續(xù)高質(zhì)量堿基長(zhǎng)度小于序列長(zhǎng)度75%的序列，去除嵌合體，最終得到可用于后續(xù)分析的優(yōu)質(zhì)序列。使用Uparse 軟件將相似性大于97%的序列聚為一個(gè)OTU。通過(guò)RDP 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU 進(jìn)行分類和物種注釋，統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣品在不同水平（門、綱、目、科、屬）的物種分類。本試驗(yàn)使用Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)來(lái)評(píng)定細(xì)菌群落的多樣性和豐富度。Shannon指數(shù)代表微生物群落的多樣性，Chao1 指數(shù)代表微生物群落的豐富度。通過(guò)層次聚類（Hierarchical clustering）中的非加權(quán)組平均法構(gòu)建（Unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA）進(jìn)化樹。所有參數(shù)使用在線Mothur軟件制作(http://www.mothur.org)。

1.2.3 Real-time PCR分析

引物序列具體見表2[5]。

表2 熒光定量PCR引物

冰上配制反應(yīng)體系，在羅氏Light Cycler? 96 PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)條件為：95 ℃、600 s；95 ℃、10 s，60 ℃、10 s，72 ℃、10 s；45個(gè)循環(huán)。根據(jù)公式2-△△ct，其中-△△ct=-（待測(cè)組目的基因平均ct值-待測(cè)組內(nèi)參基因平均ct 值）-（對(duì)照組目的基因平均ct 值-對(duì)照組內(nèi)參基因平均ct 值），計(jì)算基因表達(dá)量的相對(duì)倍數(shù)。PCR 產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS9.2軟件的PROC MIXED 模型進(jìn)行方差分析，并用Tukey's法進(jìn)行差異顯著性比較，對(duì)于不同處理指標(biāo)，在不服從正態(tài)分布時(shí)，做非參數(shù)檢驗(yàn)重新分析顯著性，P＜0.05代表差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 硝酸鹽劑量對(duì)瘤胃細(xì)菌多樣性指數(shù)的分析

本次測(cè)序共得到485 440條raw tags，經(jīng)過(guò)處理后得到481 526條effective tags，平均每個(gè)樣品含26 751條序列。以97%相似度作為閾值，共得到9 277個(gè)OTU，平均每個(gè)樣品515 個(gè)OTU。由表3 可以看出，隨著日糧硝酸鉀劑量的增加，各組間的Shannon 指數(shù)和Chao1指數(shù)無(wú)顯著差異。

2.2 硝酸鹽劑量對(duì)瘤胃細(xì)菌群落的影響

表3 硝酸鹽劑量對(duì)細(xì)菌Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)的影響

表4 硝酸鹽劑量對(duì)瘤胃細(xì)菌相對(duì)豐度的影響（門水平）

由表4 可見，湖羊瘤胃內(nèi)擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）的相對(duì)豐度總和占90%以上，說(shuō)明這3 個(gè)細(xì)菌門在本試驗(yàn)的瘤胃細(xì)菌群落中為優(yōu)勢(shì)菌群。C和D組的擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對(duì)豐度最高（P＜0.05），其它各菌門豐度在各組間無(wú)顯著差異。

不同硝酸鉀劑量的瘤胃細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)聚類結(jié)果（見圖1）顯示，不同硝酸鹽劑量的瘤胃細(xì)菌區(qū)系分為三大類，C和D組之間具有很高的相似性，E和F組之間具有很高的相似性。A和B組相似。

為進(jìn)一步探究瘤胃的菌群結(jié)構(gòu)，選取屬水平上豐度排名前35 的細(xì)菌繪制熱圖并聚類（見圖2）。由圖可知，C 和D 組的普雷沃氏菌屬（Prevotella）相對(duì)豐度最高（P＜0.05），其它菌屬豐度在各組間無(wú)顯著差異。

圖2 硝酸鹽劑量對(duì)瘤胃細(xì)菌相對(duì)豐度的影響（屬水平，前20）

為分析瘤胃細(xì)菌群落與發(fā)酵參數(shù)間的關(guān)系，以細(xì)菌群落在屬水平上的相對(duì)豐度前20的數(shù)據(jù)為物種數(shù)據(jù)，瘤胃液中日糧硝酸鹽添加量、亞硝態(tài)氮含量、pH值、氨態(tài)氮含量為變量，進(jìn)行了Speraman 分析，見圖3。由圖可知，相對(duì)豐度前20 的瘤胃細(xì)菌屬與日糧硝酸鹽添加量之間無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系，甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）的相對(duì)豐度與亞硝態(tài)氮含量呈顯著正相關(guān)（P=0.006，r=0.624 0）；瘤胃球菌屬（Ruminococcus）（P=0.016，r=-0.560 4）與氨態(tài)氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)；梭狀桿菌屬（Clostridium）、菌屬（Shuttleworthia）、糞球菌屬（Coprococcus）、丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）、假丁酸弧菌屬（Pseudobutyrivibrio）的相對(duì)豐度與瘤胃液pH 值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05，r=0.499 7-0.602 0），普雷沃氏菌屬（Prevotella）的相對(duì)豐度與瘤胃液pH值呈顯著負(fù)相關(guān)（P=0.028，r=-0.518 3）。

基于OTU 水平細(xì)菌群落與硝態(tài)氮還原產(chǎn)物進(jìn)行RDA分析，結(jié)果見圖4。有圖可知，第1排和第2排序軸分別可解釋細(xì)菌群落組成變異的36.1%和24.68%。瘤胃液pH 值與第一排序軸的關(guān)系較近（r=0.946 4），亞硝態(tài)氮?dú)埩袅亢桶睉B(tài)氮與第二排序軸的關(guān)系較近（r=0.472 3，0.596 3）。亞硝態(tài)氮?dú)埩袅?、瘤胃液氨態(tài)氮含量和pH值與日糧硝酸鉀添加量呈正相關(guān)關(guān)系，瘤胃液氨態(tài)氮含量與瘤胃液pH 值呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。未添加硝酸鉀3個(gè)平行樣本（A1、A2、A3）較集中，日糧添加18 g/d 和24 g/d 硝酸鉀的3 個(gè)平行樣本（D1、D2、D3；E1、E2、E3）較集中，且隨著硝酸鉀添加量的升高，個(gè)體動(dòng)物的細(xì)菌區(qū)系離散程度增加，說(shuō)明硝酸鉀改變了瘤胃細(xì)菌區(qū)系，但存在個(gè)體差異。

2.3 硝酸鹽劑量對(duì)瘤胃硝酸鹽還原菌相對(duì)豐度的影響

挖掘高通量測(cè)序結(jié)果，未檢測(cè)到有顯著性差異的細(xì)菌種類，且相對(duì)豐度均較低。因此，本試驗(yàn)采用RT-PCR 方法進(jìn)一步研究已報(bào)道的硝酸鹽還原菌相對(duì)豐度的差別。由圖5 可知，反芻獸新月單胞菌（S.ruminantium）的相對(duì)豐度在各硝酸鹽劑量間無(wú)顯著影響。相反，胎兒彎曲桿菌（C. fetus）的相對(duì)豐度隨硝酸鹽添加量的增加逐漸上升，F(xiàn)組最高（P＜0.01），D組和E組顯著高于A組和B組（P＜0.01）。

3 討論

硝酸鹽可為瘤胃微生物提供氮源，并且經(jīng)還原生成氨[1]。硝酸鹽對(duì)瘤胃液氨態(tài)氮水平和pH 值的影響結(jié)果不一致。Zhao等[7]報(bào)道，占日糧2%的硝酸鹽不影響瘤胃液氨態(tài)氮含量和pH 值，而不同研究表明添加硝酸鹽可提高瘤胃液氨態(tài)氮水平和pH值[4，7]。本試驗(yàn)關(guān)聯(lián)分析也發(fā)現(xiàn)硝酸鹽添加量與氨態(tài)氮和pH值呈正相關(guān)關(guān)系，這與前人結(jié)果相似。有研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)底物中加入5 mmol/l硝酸鹽，Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)無(wú)顯著差異[8]，劉麗慧等[9]體外研究表明，5 mmol/l 的硝酸鈉不影響瘤胃細(xì)菌總數(shù)。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，湖羊日糧硝酸鉀劑量達(dá)30 g/d 時(shí)不影響瘤胃細(xì)菌群落的多樣性和豐度。本試驗(yàn)通過(guò)16S rDNA測(cè)序?qū)﹂T水平湖羊瘤胃細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃中擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌門，與Perumbakkam等[10]的研究一致。Kim等[11]的研究同樣證明了，這三個(gè)菌門構(gòu)成了瘤胃的核心菌群。擬桿菌門大部分為革蘭氏陰性菌，多數(shù)菌屬有很高的多糖降解活性，擁有大量多糖分解酶基因[12-13]。Fernando 等[14]用16S rRNA 基因文庫(kù)的方法研究肉牛瘤胃微生物發(fā)現(xiàn)，采食高精料日糧組，瘤胃中擬桿菌門所占比例顯著升高，這與本試驗(yàn)選用較高精料比例日糧的結(jié)果相似。本試驗(yàn)中，擬桿菌門的相對(duì)豐度隨日糧硝酸鉀劑量的增加而先上升后下降，最高豐度時(shí)硝酸鹽劑量為12 g/d 和18 g/d。可見，適當(dāng)?shù)南跛徕泟┝靠稍黾訑M桿菌門的相對(duì)豐度，但過(guò)高的日糧硝酸鉀抑制擬桿菌門的增殖活動(dòng)。

圖3 瘤胃細(xì)菌相對(duì)豐度與發(fā)酵參數(shù)相關(guān)性分析（屬水平）

普雷沃氏菌屬為擬桿菌門內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌屬。Stevenson等[15]使用Real-time PCR的方法，對(duì)兩頭荷斯坦奶牛瘤胃液分析發(fā)現(xiàn)，普雷沃氏菌屬的相對(duì)豐度為42%～60%?？梢姡摼鷮偈橇鑫钢械某ｑv菌屬，并且有很高的豐度。普雷沃氏菌屬是擁有高活性的降解半纖維素的菌種[16]。與擬桿菌門相似，普雷沃氏菌屬的相對(duì)豐度在日糧含有硝酸鉀12 g/d 和18 g/d 時(shí)最高，并隨著硝酸鉀劑量的升高而下降，說(shuō)明該菌屬豐度受硝酸鉀劑量的影響。關(guān)于普雷沃氏菌的相對(duì)豐度與pH值之間的關(guān)系報(bào)道不一致。林波等[17]報(bào)道全粗料日糧使普雷沃氏菌科的相對(duì)豐度顯著升高，Zhao等[7]報(bào)道添加硝酸鹽不改變?nèi)馀Ａ鑫敢浩绽孜质暇鷮傧鄬?duì)豐度。本研究結(jié)果表明普雷沃氏菌屬相對(duì)豐度與瘤胃液pH值呈顯著負(fù)相關(guān)。不同的結(jié)果原因可能是硝酸鹽的添加劑量及動(dòng)物品種差異導(dǎo)致。厚壁菌門中以纖維分解菌為主[18]，本試驗(yàn)檢測(cè)到的5 種與瘤胃液pH值呈顯著相關(guān)的菌屬均屬于厚壁菌門。本試驗(yàn)中瘤胃球菌屬相對(duì)豐度與瘤胃液硝酸鹽添加量無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系，這與Wang 等[1]的研究結(jié)果一致；Patra等[19]研究也表明黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌相對(duì)豐度不受硝酸鹽的影響。本試驗(yàn)丁酸弧菌屬、梭狀桿菌屬、糞球菌屬的相對(duì)豐度與pH 值呈顯著正相關(guān)，但不受硝酸鹽添加劑量的影響，這與Zhao 等[7]結(jié)果相似。

圖4 瘤胃細(xì)菌相對(duì)豐度與硝態(tài)氮發(fā)酵參數(shù)相關(guān)性分析（屬水平）

圖5 不同硝酸鹽添加量對(duì)反芻獸新月單胞菌和胎兒彎曲桿菌相對(duì)豐度的影響

反芻獸新月單胞菌是Iwamoto 等[3]研究提出的瘤胃還原硝酸鹽的細(xì)菌（反芻獸新月單胞菌，小韋榮氏球菌和產(chǎn)琥珀酸沃廉菌）中起主要作用且數(shù)量最多的細(xì)菌。Asanuma等[4]證明該菌在硝酸鹽還原過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，且能夠降解淀粉等可溶性碳水化合物。Yoshii 等[20]的研究表明，淀粉分解菌能增強(qiáng)反芻獸新月單胞菌還原硝酸鹽的能力。本試驗(yàn)中小韋榮氏球菌和產(chǎn)琥珀酸沃廉菌并未出現(xiàn)在排名前20的屬中，可能因?yàn)檫@兩種菌在瘤胃內(nèi)的含量極少。本試驗(yàn)通過(guò)Real-time PCR 可以看出，各組間反芻獸新月單胞菌的基因拷貝數(shù)并無(wú)顯著差異，與16S rDNA 高通量測(cè)序結(jié)果一致。胎兒彎曲桿菌在瘤胃內(nèi)的總量很少[5,7]，且多報(bào)道為病原菌[21]。但該菌可隨硝酸鹽添加量的升高而升高，并具有潛在的還原硝酸鹽和亞硝酸鹽的能力[5]。這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。盡管本研究前期結(jié)果表明動(dòng)物血液中的高鐵血紅蛋白含量隨硝酸鹽添加量的增加而升高，但未出現(xiàn)中毒癥狀[22]，由于胎兒彎曲桿菌的病原性，本試驗(yàn)推測(cè)過(guò)高劑量的硝酸鹽對(duì)瘤胃細(xì)菌正常區(qū)系有一定的危害。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了不同日糧硝酸鉀劑量對(duì)湖羊瘤胃細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門是優(yōu)勢(shì)菌群。日糧含12 g/d和18 g/d的硝酸鉀增加了湖羊瘤胃擬桿菌門、普雷沃氏菌屬和胎兒彎曲桿菌的相對(duì)豐度，但過(guò)高的硝酸鉀抑制優(yōu)勢(shì)菌群的增殖。