肖艷萍，鐘橋石，胡龍華

馬爾尼菲籃狀菌是一種重要的條件致病菌，其感染具有一定的地區(qū)分布特點(diǎn)，主要見于東南亞、中國、印度等地區(qū)[1]。以前多見于HIV感染患者，在有效的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的作用下，HIV患者感染馬爾尼菲籃狀菌的比例在逐漸減少，而隨著器官移植、造血干細(xì)胞移植、免疫抑制劑、新型靶向治療藥物如抗CD20單克隆抗體使用的增多，非HIV感染患者的病例在逐漸增加[2]。馬爾尼菲籃狀菌感染患者如未能及時(shí)接受抗真菌治療往往預(yù)后不良，甚至死亡[3]。本文就目前馬爾尼菲籃狀菌相關(guān)致病機(jī)制及調(diào)控基因的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 馬爾尼菲籃狀菌的雙相性轉(zhuǎn)變及相關(guān)信號(hào)通路傳導(dǎo)

馬爾尼菲籃狀菌是一種雙相真菌，其表現(xiàn)出溫度依賴雙相性生長(zhǎng)——25 ℃時(shí)的菌絲相和37℃時(shí)的酵母菌相。目前，研究認(rèn)為雙相性的轉(zhuǎn)變是菌體逃避宿主免疫反應(yīng)的一種應(yīng)答機(jī)制。當(dāng)馬爾尼菲籃狀菌暴露于25 ℃的外界環(huán)境中時(shí)，霉菌菌絲分化可產(chǎn)生無性孢子(分生孢子)，分生孢子被吸入患者肺內(nèi)后可被宿主先天免疫細(xì)胞識(shí)別，繼而引起宿主對(duì)外來物質(zhì)的殺傷作用。對(duì)于普遍的真菌病原體來說，當(dāng)真菌進(jìn)入宿主肺內(nèi)，真菌細(xì)胞壁上含有一種特殊成分稱為病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)，其可被先天性免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)膜上的膜相關(guān)模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors, PRRs)識(shí)別并驅(qū)動(dòng)下游細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，引起多種細(xì)胞免疫反應(yīng)，如吞噬作用、細(xì)胞因子的產(chǎn)生、炎性物質(zhì)的激活、活性氧的產(chǎn)生來破壞真菌細(xì)胞[4]。而對(duì)馬爾尼菲籃狀菌來說，它可在吞噬細(xì)胞內(nèi)的存活并有效隔絕宿主其他免疫成分從而有效逃避宿主的防御反應(yīng)。在這個(gè)過程中，馬爾尼菲籃狀菌雙相性的轉(zhuǎn)變——從多細(xì)胞的菌絲形態(tài)轉(zhuǎn)變成單細(xì)胞的酵母形態(tài)，是保護(hù)其在吞噬細(xì)胞內(nèi)存活的重要機(jī)制。它可有效避免在被吞噬細(xì)胞吞噬后因菌絲生長(zhǎng)時(shí)間過長(zhǎng)而導(dǎo)致細(xì)胞破裂，繼而暴露于宿主的免疫系統(tǒng)中[6]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，雙相性真菌的酵母相和菌絲相細(xì)胞壁PAMPs成分存在差異，可引起不同的炎癥反應(yīng)[4]。酵母相真菌常常缺失了部分菌絲相細(xì)胞壁PAMPs，這幫助了酵母相細(xì)胞在吞噬細(xì)胞的存活[4]。而在這些過程中，馬爾尼菲籃狀菌具有的復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制以及抗吞噬細(xì)胞殺傷作用是保證其在吞噬細(xì)胞的存活的關(guān)鍵。其中這些信號(hào)通路包括雙組分系統(tǒng)、異三聚體蛋白系統(tǒng)(G蛋白系統(tǒng))、Ras信號(hào)系統(tǒng)以及下游絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號(hào)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)(見圖1)，但這些信號(hào)通路調(diào)控馬爾尼菲籃狀菌在吞噬細(xì)胞的存活的機(jī)制目前尚不清楚。

雙組分信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)是HHK接受環(huán)境刺激后產(chǎn)生磷酸化，然后將磷酸基團(tuán)傳遞給RR，RR可激活MAPK通路進(jìn)而調(diào)節(jié)馬爾尼菲籃狀菌雙相性的轉(zhuǎn)變；G蛋白系統(tǒng)是當(dāng)接受外來刺激后，G蛋白中的α亞基發(fā)生磷酸化Gα-GTP復(fù)合物，G蛋白解離成Gα-GTP及Gβγ亞單位，Gα-GTP可通過激活PKA通路調(diào)節(jié)馬爾尼菲籃狀菌形態(tài)的轉(zhuǎn)變；Ras、Rho GTP酶及其信號(hào)通路是馬爾尼菲籃狀菌中的Ras GTP酶RasA可以激活Rho GTP酶CflA，隨后通過cAMP/PKA通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的極化生長(zhǎng)及細(xì)胞分裂。圖1 馬爾尼菲籃狀菌雙相性轉(zhuǎn)變相關(guān)信號(hào)通路[1,5]Fig.1 Signalling pathways controlling dimorphic switch of Talaromyces marneffei

1.1雙組分信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng) 雙組分信號(hào)系統(tǒng)在馬爾尼菲籃狀菌雙相性轉(zhuǎn)變中發(fā)揮重要作用，當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，馬爾尼菲籃狀菌產(chǎn)生不同的信號(hào)導(dǎo)致形態(tài)的轉(zhuǎn)變以適應(yīng)環(huán)境變化。在細(xì)菌中，主要存在組氨酸蛋白激酶(histidine kinase, HK)接受外周環(huán)境變化及響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(response regulator, RR)。HK通過感知環(huán)境變化并發(fā)生磷酸化，將磷酸化信號(hào)傳遞給RR受體，繼而直接調(diào)節(jié)基因表達(dá)或激活MAPK通路。而在真菌中，HK和RR融合成為雜合HK (hybrid histidine kinase, HHK)，并且通過磷酸轉(zhuǎn)移蛋白(phosphotransfer protein, HPt)和第二RR發(fā)生磷酸化，從而介導(dǎo)基因表達(dá)或激活信號(hào)通路。在釀酒酵母菌中，分別存在由SLN1和YPD1編碼的HHK和HPt，以及由SSK1和SKN7編碼的第二RR，構(gòu)成Sln1-Ypd1-Skn7系統(tǒng)，其可分別因氧化應(yīng)激及滲透壓的改變而激活，繼而啟動(dòng)MAPK通路。而在其它真菌中，具有多種HHKs(包括11類)來感受不同環(huán)境的變化[5]。在馬爾尼菲籃狀菌中，目前已發(fā)現(xiàn)存在兩類HHKs，即DrkA及SlnA，兩者的缺失都會(huì)導(dǎo)致對(duì)滲透壓的敏感性增加，并通過調(diào)節(jié)SakA磷酸化水平來調(diào)節(jié)HOG-MAPK通路[6]。研究表明，drkA的缺失會(huì)使細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)分布異常并增加對(duì)細(xì)胞壁結(jié)合劑的敏感性，破壞細(xì)胞壁的完整性，同時(shí)drkA基因可明顯促進(jìn)無性繁殖及酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)[7]。而slnA的突變可抑制吞噬細(xì)胞內(nèi)的分生孢子的萌芽，從而影響分生孢子向酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)變[6]。此外，sakA突變體使分生孢子不能轉(zhuǎn)變?yōu)榻湍赶嘈螒B(tài)，提示sakA也參與了37 ℃酵母相的轉(zhuǎn)變[8]。這些因素都有可能對(duì)馬爾尼菲籃狀菌的致病潛能造成重要影響。

1.2G蛋白系統(tǒng) 在馬爾尼菲籃狀菌中，分生孢子是感染的繁殖體，隨著溫度的改變，分生孢子萌發(fā)產(chǎn)生不同的形態(tài)。分生孢子在轉(zhuǎn)變成酵母細(xì)胞的過程中，分生孢子通過極性生長(zhǎng)形成關(guān)節(jié)孢子，并逐漸延伸，最后裂變成酵母細(xì)胞[9]。因此，分生孢子的極化萌發(fā)是決定其致病性的關(guān)鍵因素。研究表明，G蛋白系統(tǒng)在眾多真菌分生孢子的形成、形態(tài)的改變及對(duì)氧化應(yīng)激的適應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用。當(dāng)接受外來刺激時(shí)，G蛋白α亞基發(fā)生磷酸化形成Gα-GTP復(fù)合物，導(dǎo)致G蛋白三聚體結(jié)構(gòu)解離為Gα-GTP及Gβγ2個(gè)亞單位，它們分別激活不同的效應(yīng)蛋白，引起真菌對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)性改變。Zuber等[10]發(fā)現(xiàn)馬爾尼菲菌中GasA(編碼G蛋白α亞基)的缺失會(huì)產(chǎn)生厚的氣生菌絲及真菌分生孢子的減少，對(duì)真菌的無性發(fā)育產(chǎn)生負(fù)性影響。同時(shí)，Zuber等[11]還發(fā)現(xiàn)另一種編碼G蛋白α亞基的GasC基因具有類似GasA基因作用，負(fù)性調(diào)節(jié)馬爾尼菲籃狀菌的無性發(fā)育，GasC的缺失還會(huì)影響馬爾尼菲籃狀菌的出芽速度。

1.3Ras、Rho GTP酶及其信號(hào)通路 細(xì)胞的極化在馬爾尼菲籃狀菌形態(tài)轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮了重要作用。而其中肌動(dòng)蛋白在細(xì)胞骨架的構(gòu)建及細(xì)胞極化中極為關(guān)鍵。Ras和Rho GTPases是肌動(dòng)蛋白構(gòu)建細(xì)胞骨架中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[1]。馬爾尼菲籃狀菌Ras和Rho GTPases家族中的ClfA、RasA在37 ℃酵母細(xì)胞的形態(tài)改變以及25 ℃時(shí)菌絲形態(tài)的形成中發(fā)揮重要作用[1]，而ClfB則影響該菌無性期發(fā)育和菌絲相生長(zhǎng)，但不影響酵母細(xì)胞生長(zhǎng)[12]。

2 在吞噬細(xì)胞內(nèi)的存活及免疫逃避機(jī)制

馬爾尼菲籃狀菌侵入人體的第一步是通過吸入環(huán)境中的分生孢子進(jìn)入肺部，并通過纖維連接蛋白、層粘連蛋白、硫酸軟骨素、肝素和高度硫酸化的殼聚糖[13]等各種細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合附著在支氣管肺泡上皮細(xì)胞。吞噬細(xì)胞作為抵抗真菌感染的首要防線，可吞噬侵入的微生物并產(chǎn)生殺傷作用(包括吞噬體的形成、細(xì)胞內(nèi)pH的調(diào)節(jié)、營養(yǎng)物質(zhì)的限制等)。當(dāng)馬爾尼菲籃狀菌被吞噬細(xì)胞吞噬后，其可通過色素的合成、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶-過氧化物酶、熱休克蛋白等多種機(jī)制抵抗吞噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而使馬爾尼菲籃狀菌在吞噬細(xì)胞中存活并導(dǎo)致巨噬細(xì)胞裂解，繼而引起播散性感染[14]。

馬爾尼菲籃狀菌具有yapA基因可編碼Yap1類似物轉(zhuǎn)錄因子YapA。在釀酒酵母中，亮氨酸拉鏈蛋白家族中的Yap1是氧化應(yīng)激反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)器。細(xì)胞通過嚴(yán)格的調(diào)節(jié)機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)過氧化物及其他活性氧的濃度。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度增高時(shí)，Yap1可在氧化應(yīng)激條件下被激活。而Yap1功能的缺失將導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)氧自由基的敏感度增高，同時(shí)導(dǎo)致超氧化物歧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、谷胱甘肽還原酶活性降低，引起細(xì)胞損傷[15]。馬爾尼菲籃狀菌中也具有Yap1的類似物YapA，Wiyada Dankai等[16]發(fā)現(xiàn)YapA的突變會(huì)導(dǎo)致發(fā)芽以及產(chǎn)孢的延遲，提高氧化應(yīng)激反應(yīng)的敏感性，從而導(dǎo)致真菌在吞噬細(xì)胞內(nèi)存活率降低。這間接反映yapA基因參與了抗吞噬細(xì)胞的殺傷作用。

3 代謝合成相關(guān)的編碼基因

3.1與黑色素合成相關(guān)的基因 黑色素是一類廣泛存在于微生物中的一類特殊的色素，是真菌的一個(gè)重要的毒力因子，同時(shí)也為真菌的存活提供重要的保護(hù)作用。馬爾尼菲籃狀菌也分泌黑色素，并在馬爾尼菲籃狀菌的致病性和存活方面發(fā)揮重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，黑色素具有對(duì)抗各種非特異性壓力(例如紫外線、氧化劑、酶裂解、極端高溫和低溫下)、清除氧自由基保護(hù)真菌免受由氧或氮衍生的自由基介導(dǎo)的損傷、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞因子水平及增強(qiáng)真菌對(duì)藥物的抵抗性等作用[17-18]。

黑色素可根據(jù)其合成途徑的不同可分為DOPA-黑色素和DHN-黑色素，目前認(rèn)為馬爾尼菲籃狀菌既可通過DOPA途徑，也可通過DHA途徑合成黑色素[19-20]。在多種真菌中發(fā)現(xiàn)，黑色素的合成涉及多個(gè)基因簇，其中包括聚酮化合物、柱孢還原酶、羥基萘還原酶、多銅氧化酶、漆酶合成相關(guān)基因等[21]。在馬爾尼菲籃狀菌中也發(fā)現(xiàn)PKS合成相關(guān)基因及編碼漆酶的基因參與黑色素的合成，PKS催化丙二醇CoA或者乙酸轉(zhuǎn)化1,3,6,8-THN，漆酶在1,8-DHN轉(zhuǎn)化為黑色素中起關(guān)鍵作用[20]，相關(guān)基因的突變可影響黑色素的合成。Woo等[22]發(fā)現(xiàn)敲除參與PKS合成的alb1基因的突變株合成的黑色素明顯減少，且其感染小鼠的存活率明顯高于野生株。同時(shí)，編碼漆酶的pbrB基因的缺失同樣會(huì)引起黑色素合成的減少。

3.2磷脂酶 細(xì)胞外磷脂酶作為一種可有效分解細(xì)胞膜脂質(zhì)成分并裂解細(xì)胞膜的物質(zhì)已被廣泛證實(shí)可作為病原菌的一種通用毒力因子。磷脂酶是一類可水解甘油磷脂中一個(gè)或多個(gè)酯鍵的酶，根據(jù)其水解不同酯鍵的能力，可將磷脂酶分為磷脂酶A、B、C、D。在微生物侵入宿主過程中，裂解宿主細(xì)胞膜或破壞宿主細(xì)胞膜的功能是微生物突破進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)的必要環(huán)節(jié)，而磷脂酶可有效分解細(xì)胞膜的脂質(zhì)成分導(dǎo)致細(xì)胞膜的損傷和裂解。這一功能是磷脂酶被認(rèn)為細(xì)菌和真菌的重要毒力因子的重要原因。而在白色念珠菌、新生隱球菌、煙曲霉等的研究都證實(shí)了磷脂酶與真菌的致病性密切相關(guān)[23]。Yan He等[23]研究表明細(xì)胞內(nèi)磷脂酶B在馬爾尼菲籃狀菌酵母相(致病相)中表達(dá)明顯高于菌絲相，同時(shí)證明了磷脂酶B在馬爾尼菲籃狀菌的致病性中發(fā)揮積極作用。雖目前尚無證據(jù)表明磷脂酶在馬爾尼菲籃狀菌致病機(jī)制中的作用，但可作為未來進(jìn)一步研究方向。

3.3其他聚酮類化合物合成相關(guān)的編碼基因 聚酮化合物是微生物廣泛合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物，包括色素、抗生素及真菌毒素等；其生物活性多樣，可為微生物在宿主內(nèi)存活提供生存優(yōu)勢(shì)。除了黑色素外，其他聚酮化合物也與馬爾尼菲籃狀菌的致病性密切相關(guān)。這類化合物的生物合成過程均產(chǎn)生含有多個(gè)酮基的中間產(chǎn)物，聚酮合酶(Polyketide synthase, PKS) 是催化這類中間產(chǎn)物合成的關(guān)鍵酶。其中馬爾尼菲籃狀菌的黃色素是由絲紅醇及絲紅酸組成，分別由PKS-11和PKS-12基因編碼合成。其突變體產(chǎn)生的黃色色素明顯低于野生型，且野生菌株在吞噬細(xì)胞的存活率高于突變株，表明由PKS催化合成的絲紅醇及絲紅酸可增強(qiáng)馬爾尼菲籃狀菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活率[24]。

4 MP1p蛋白及相關(guān)編碼基因

MP1p是一種由MP1基因編碼的細(xì)胞壁表面的甘露糖蛋白，曾作為一種免疫性抗原，用于馬爾尼菲籃狀菌感染的檢測(cè)。但最新研究發(fā)現(xiàn)，MP1p是馬爾尼菲籃狀菌一種新的毒力因子，其在宿主體內(nèi)的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[25]。MP1p共有462個(gè)氨基酸殘基，包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為脂質(zhì)結(jié)合域1(Mp1p-LBD1)、脂質(zhì)結(jié)合域2(Mp1p-LBD2)及C-羧基末端富含絲氨酸和蘇氨酸的區(qū)域[25]。Woo等[26]分別用含有MP基因、MP1互補(bǔ)基因、MP1敲除的馬爾尼菲籃狀菌菌株感染Balb/c小鼠，發(fā)現(xiàn)MP1的表達(dá)量與菌體在小鼠巨噬細(xì)胞的存活率呈現(xiàn)正相關(guān)。Kong-Hung Sze等[25]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Mp1p-LBD2是一種具有長(zhǎng)疏水中心的5螺旋結(jié)構(gòu)束狀單體，對(duì)花生四烯酸(arachidonic acid, AA)具有極高的親和力，可以捕獲并封閉1-2個(gè)AA，使細(xì)胞內(nèi)AA水平減少，進(jìn)而抑制下游AA代謝產(chǎn)物及促炎性因子IL-6和TNF-a的釋放，最終降低機(jī)體的炎癥反應(yīng)。

5 展 望

馬爾尼菲籃狀菌是一種雙相真菌，具有區(qū)別于其他真菌的致病機(jī)制及機(jī)體相對(duì)應(yīng)的防御機(jī)制。本文從分子層面回顧了馬爾尼菲籃狀菌致病機(jī)制，著重綜述了菌體雙相性轉(zhuǎn)變的相關(guān)信號(hào)通路及可能調(diào)控基因，馬爾尼菲被吞噬細(xì)胞吞噬后氧化殺傷的分子應(yīng)答，以及其他致病毒力因子。馬爾尼菲籃狀菌首先通過相變的發(fā)生逃避宿主對(duì)一般真菌識(shí)別殺傷從而進(jìn)入人體；其次在吞噬細(xì)胞中馬爾尼菲籃狀菌通過黑色素的產(chǎn)生以及一些代謝產(chǎn)物的形成的方式來逃避吞噬細(xì)胞的殺傷作用。此外，馬爾尼菲籃狀菌分泌了一種特殊的糖蛋白—Mp1p蛋白，這是一種新的毒力因子，其可通過捕獲一種關(guān)鍵的脂質(zhì)促炎因子以逃避宿主的先天性免疫防御，可為日后研究真菌如何逃脫宿主免疫提供新的見解及方法。但關(guān)于雙相性轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵啟動(dòng)因子及其相關(guān)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，以及躲避宿主免疫應(yīng)答的具體機(jī)制，目前尚無明確定論，有待進(jìn)一步研究。

利益沖突：無

引用本文格式：肖艷萍，鐘橋石，胡龍華.馬爾尼菲籃狀菌致病機(jī)制相關(guān)分子研究進(jìn)展[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2020，36(1):70-74. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.190