高俊杰，魏愷瑩，陳 達(dá)

(沈陽(yáng)理工大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，沈陽(yáng) 110159)

蛋白質(zhì)是人體生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)[1]，也是人體中的機(jī)體組織及各項(xiàng)器官重要組成部分，且參與人體生命活動(dòng)的整個(gè)過(guò)程中[2]。人體需要從食品中攝取大量蛋白質(zhì)，為生命活動(dòng)提供所需的能量。蛋白質(zhì)的測(cè)定方法有凱氏定氮法[3]、考馬斯亮藍(lán)(Bradford)法[4]、熒光法[5]、共振瑞利散射法等[6]。

染料與蛋白質(zhì)反應(yīng)的產(chǎn)物通過(guò)熒光法、共振瑞利散射法測(cè)定的方法很多，大多是以形成二元絡(luò)合物為主。如果在反應(yīng)體系中加入金屬離子，使其形成染料-金屬配合物，比使用單一試劑的靈敏度要高，結(jié)合要強(qiáng)。因此，三元絡(luò)合物體系具有廣大的研究空間[7-8]。

茜素綠又叫酸性綠25(AG25)，是一種常用的蒽醌染料、生物染色劑，也用于光度法的顯色劑等，其與蛋白質(zhì)的反應(yīng)已經(jīng)用于光度法、瑞利散射法的檢測(cè)中[9]，但都局限在二元體系中，形成三元絡(luò)合物的瑞利散射法還未見(jiàn)報(bào)道。本文在二元反應(yīng)體系中加入銅離子，在一定條件下形成三元絡(luò)合物，使測(cè)定靈敏度大大增加，建立測(cè)定蛋白質(zhì)的新方法，通過(guò)對(duì)實(shí)際樣品的蛋白質(zhì)含量測(cè)定，結(jié)果滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

日立F-2500熒光分光光度計(jì)(日立公司，日本)，pHS-3C酸度計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；2×10-2g/L牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液(BSA)；2×10-2g/L卵白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液(Ova)；4×10-2g/L茜素綠溶液；B-R緩沖溶液；0.1g/L硫酸銅溶液。

所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

于10mL比色管中依次加入1.5mL的4×10-2g/L茜素綠溶液、適量的蛋白質(zhì)溶液、1mL的B-R緩沖溶液(pH=4.35)、1mL的0.1g/L硫酸銅溶液，再用蒸餾水稀釋至刻度，并充分搖勻后靜置15min待測(cè)。

熒光分光光度計(jì)設(shè)定以λex=λem在一定波長(zhǎng)范圍進(jìn)行同步掃描(激發(fā)狹縫寬度與發(fā)射狹縫寬度均為5.0nm)，記錄系統(tǒng)的共振瑞利散射光譜，并于最大共振瑞利散射處(370nm)測(cè)得絡(luò)合物散射光強(qiáng)度I和試劑空白的散射光強(qiáng)度I0，計(jì)算測(cè)量相對(duì)強(qiáng)度ΔI，ΔI=I-I0。

2 結(jié)果與討論

2.1 共振瑞利散射光譜

按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定共振瑞利散射譜，如圖1所示。

圖1中，在370nm與468nm處出現(xiàn)兩個(gè)RRS峰，其中370nm處有更高的散射光強(qiáng)度，且空白值低，具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確性。因此，測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)選擇370nm處散射光強(qiáng)度作為測(cè)量值。測(cè)定蛋白質(zhì)體系時(shí)，三元體系(曲線5)比二元體系(曲線4)有更強(qiáng)散射光強(qiáng)度。

2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.2.1 B-R緩沖液酸度的影響

實(shí)驗(yàn)不同酸度對(duì)三元絡(luò)合物體系散射光強(qiáng)度的影響。保持其他反應(yīng)條件不變，每份固定加入1.5mL的4×10-2g/L茜素綠溶液、1mL的0.1g/L硫酸銅溶液、1mL不同酸度的B-R緩沖溶液，如圖2所示，結(jié)果顯示pH=4.35時(shí)得到的散射強(qiáng)度數(shù)值最大，因此宜選擇pH=4.35的B-R緩沖溶液。

2.2.2 B-R緩沖液用量的影響

按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定不同緩沖溶液用量的影響，保持其他反應(yīng)條件不變，每份固定加入1.5mL的4×10-2g/L茜素綠溶液、1mL的0.1g/L硫酸銅溶液，如圖3所示。結(jié)果表明B-R緩沖溶液用量在1mL時(shí)效果最好，因此B-R緩沖溶液緩沖溶液用量宜選為1mL。

2.2.3 染料茜素綠用量的影響

保持其他反應(yīng)條件不變，每份固定加入1mL的B-R緩沖溶液(pH=4.35)、1mL的0.1g/L硫酸銅溶液。按實(shí)驗(yàn)方法在一定范圍內(nèi)改變茜素綠用量，測(cè)定相對(duì)共振瑞利散射強(qiáng)度相應(yīng)的變化，如圖4所示。結(jié)果表明茜素綠用量在1.5mL時(shí)效果最好，故茜素綠用量宜取為1.5mL。

2.2.4 銅離子用量的影響

保持其他反應(yīng)條件不變，每份固定加入1.5mL的4×10-2g/L茜素綠溶液、1mL的B-R緩沖溶液(pH=4.35)。測(cè)試銅離子用量對(duì)體系的影響，如圖5所示。結(jié)果表明，隨著銅離子的增加，體系散射強(qiáng)度不斷增加，當(dāng)達(dá)到1mL(0.1g/L的硫酸銅溶液)后強(qiáng)度不再增加，故銅離子用量宜取為1mL。

2.2.5 反應(yīng)溫度的影響

加入1.5mL的4×10-2g/L茜素綠溶液，1mL的0.1g/L硫酸銅溶液，1mL的B-R緩沖溶液(pH=4.35)。測(cè)定在不同溫度時(shí)反應(yīng)體系的散射強(qiáng)度，如圖6所示。結(jié)果顯示在10～50℃時(shí)基本穩(wěn)定，當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，散射強(qiáng)度有顯著提升；但要考慮蛋白質(zhì)易變性的特點(diǎn)，溫度過(guò)高，蛋白質(zhì)失活。因此溫度選擇在室溫的條件下進(jìn)行即可。

2.2.6 反應(yīng)時(shí)間的影響

實(shí)驗(yàn)加入1.5mL的4×10-2g/L茜素綠溶液，1mL的0.1g/L硫酸銅溶液，1mL的B-R緩沖溶液(pH=4.35)。測(cè)試反應(yīng)時(shí)間的影響，如圖7所示。結(jié)果表明，在10～30min時(shí)，溶液反應(yīng)完全，體系呈穩(wěn)定狀態(tài)，測(cè)量的熒光強(qiáng)度基本穩(wěn)定。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，體系的散射光強(qiáng)度開始降低，故最佳的反應(yīng)時(shí)間為15min。

2.2.7 試劑加入順序的影響

不同的試劑加入順序會(huì)影響體系的組成與穩(wěn)定性，對(duì)實(shí)驗(yàn)所測(cè)量的散射光強(qiáng)度也會(huì)造成影響。按照表1中不同的加入順序進(jìn)行測(cè)定、分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。

表1 試劑加入順序?qū)w系散射光強(qiáng)度的影響

由表1和圖8可知，最佳加入順序應(yīng)為第2組(茜素綠、蛋白質(zhì)、B-R緩沖溶液、銅)，此種加入順序效果最好，靈敏度最高。

2.2.8 離子強(qiáng)度的影響

通過(guò)向1.5mL的4×10-2g/L茜素綠溶液、蛋白質(zhì)、1mL的0.1g/L硫酸銅溶液、1mL的B-R緩沖溶液(pH=4.35)組成的三元絡(luò)合物體系中添加不同濃度的氯化鈉溶液，改變體系的離子強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(如圖9所示)表明，改變氯化鈉濃度對(duì)試劑空白影響不大，但三元絡(luò)合物體系會(huì)產(chǎn)生影響。當(dāng)氯化鈉濃度小于3.42×10-3mol/L時(shí)，相對(duì)共振瑞利散射強(qiáng)度幾乎沒(méi)有變化。但當(dāng)氯化鈉濃度大于3.42×10-3mol/L時(shí)，隨著氯化鈉濃度的進(jìn)一步增加，散射強(qiáng)度出現(xiàn)明顯減小。因此，當(dāng)溶液中離子強(qiáng)度稍大時(shí)會(huì)對(duì)體系造成影響，離子會(huì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合蛋白質(zhì)，也會(huì)屏蔽茜素綠與蛋白質(zhì)的電荷，使茜素綠與蛋白質(zhì)的結(jié)合力降低。產(chǎn)生的這一現(xiàn)象也可表明，茜素綠與蛋白質(zhì)的結(jié)合力有一部分是靜電引力作用的。實(shí)驗(yàn)中如果離子強(qiáng)度變化較大時(shí)應(yīng)考慮其影響。

2.2.9 絡(luò)合物組成的測(cè)定

按實(shí)驗(yàn)方法，以Cu(Ⅱ)與茜素綠的摩爾比為橫坐標(biāo)，以散射光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，試驗(yàn)不同比例下的散射光強(qiáng)度，如圖10所示。結(jié)果表明，當(dāng)銅離子與茜素綠摩爾比為4∶1時(shí)，測(cè)定值出現(xiàn)了拐點(diǎn)，故Cu(Ⅱ)與茜素綠的摩爾比，即絡(luò)合物組成比宜取為4∶1。

2.2.10 共存物質(zhì)的影響

表2 共存物質(zhì)對(duì)茜素綠-蛋白質(zhì)-Cu(Ⅱ)三元絡(luò)合物體系散射光強(qiáng)度的影響

3 線性回歸方程

在優(yōu)化反應(yīng)條件下，按實(shí)驗(yàn)方法對(duì)不同濃度的牛血清白蛋白(BSA)與卵蛋白(Ova)溶液進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性回歸方程檢出限，相關(guān)系數(shù)如表3所示(濃度點(diǎn)n=5)。

表3 兩種蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

由表3可知，兩種蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢出限都在0.16mg/L以內(nèi)，相關(guān)系數(shù)都在0.99以上，因此這種測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法靈敏度與準(zhǔn)確度都較高。

4 樣品的測(cè)定

測(cè)定兩種蛋白：動(dòng)物蛋白(牛奶)、植物蛋白(豆?jié){)樣品中的總蛋白質(zhì)。將樣品稀釋2000倍，分取適量溶液按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定，同時(shí)做加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表4所示(n=5)。

表4 樣品中蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果及回收率

由表4看出，測(cè)得的兩種樣品的加標(biāo)回收率都在96%以上，相對(duì)偏差較小。因此共振瑞利散射法測(cè)定蛋白質(zhì)含量同樣具有可行性與準(zhǔn)確性。

5 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)建立了一種三元絡(luò)合物體系共振瑞麗散射測(cè)定蛋白質(zhì)的新方法，三元絡(luò)合物體系比二元體系靈敏度更高。實(shí)際樣品的測(cè)定也表明此方法有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，可以準(zhǔn)確測(cè)定不同樣品中的蛋白質(zhì)含量，結(jié)果滿意。此方法應(yīng)用于牛奶、豆?jié){等樣品中的蛋白質(zhì)的含量，有很好的應(yīng)用性。