杜民，李娜，牛寶珍，周亞，陳春麗，文天仙，王興龍

(1.湖南文理學院 生命與環(huán)境科學學院,環(huán)洞庭湖水產(chǎn)健康養(yǎng)殖及加工湖南省重點實驗室,水產(chǎn)生物資源與環(huán)境生態(tài)湖南省工程研究中心,動物學湖南省高校重點實驗室,湖南 常德 415000；2.紅河學院 云南省高校農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點實驗室,云南 蒙自 661199)

巨魾Bagariusyarrelli(Sykes)隸屬于鲇形目Siluriformes鮡科Sisoridae魾屬Bagarius[1-2]，是云南省特有底棲肉食性魚類，主要分布于紅河、瀾滄江、怒江流域[2]。巨魾全身無鱗，身體兩側(cè)各有一條明顯的側(cè)線，從頭部鰓蓋末端上緣貫穿全身至尾柄末端；皮膚上布滿細密的微小顆粒物，使之皮膚較為粗糙，體表無黏液，體色灰黃，腹面較白，肌肉呈黃色，俗稱為“黃魚”[3]。田樹魁等[4]比較了巨魾、叉尾鲇Wallagoattu、斑點叉尾鮰Letaluruspunetaus3 種魚肌肉中常規(guī)營養(yǎng)成分和氨基酸含量，發(fā)現(xiàn)巨魾肌肉中蛋白質(zhì)含量比鯉、鯽、草魚等魚類高，表明巨魾是一種具有較高營養(yǎng)價值的有待馴養(yǎng)開發(fā)的野生魚類。杜民等[5]研究表明，云南紅河的河口江段野生巨魾具有較高的遺傳多樣性。但由于環(huán)境改變和人為影響，野生巨魾資源越來越少，巨魾現(xiàn)已被列入《云南省水生野生動物保護名錄》[6]。因此，對巨魾的遺傳多樣性研究具有重要的理論意義。

線粒體DNA(mtDNA)是一種細胞核外(細胞質(zhì))遺傳物質(zhì)，與核DNA相比,具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、進化速度快、母性遺傳、無組織特異性及提取方便等特點[7]，可以半保留復制方式進行自我復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的共價閉合環(huán)狀雙鏈DNA。在脊椎動物中,mtDNAND4 基因(脫氫酶第四亞基)是編碼蛋白基因[8]，位于L鏈上。研究表明,ND4基因與其他線粒體基因相比，在重建親緣關(guān)系較遠類群間的系統(tǒng)進化速率適中[9]。丁言偉等[10]利用ND4基因研究了黃顙魚屬兩種黃顙魚在不同水系中的遺傳進化關(guān)系；劉思情等[11]在鰍超科魚類系統(tǒng)進行ND4基因序列分析，表明鰍超科魚類ND4基因全長為1380～1387 bp，以ATG為起始密碼子，終止密碼子為不完全終止信號，A+T含量高于C+G含量；王莉等[12]利用線粒體ND4基因?qū)?種條紋光唇魚的系統(tǒng)進化進行了研究。近年來，有關(guān)巨魾的研究主要集中在生理、繁殖、微衛(wèi)星標記開發(fā)和線粒體基因方面[3-5]，未見有巨魾ND4基因的研究報道。為此，本試驗中以云南省境內(nèi)特有的巨魾6個野生群體為研究對象，對其ND4基因堿基序列的變異情況進行分析，探討6個群體的遺傳多樣性及其之間的親緣關(guān)系，旨在為巨魾的種質(zhì)資源保護和人工繁殖提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗以紅河州蒙自市曼耗鎮(zhèn)(Baya-M)、怒江州龍陽縣三江口鎮(zhèn)段即怒江下游(Baya-N)、怒江州保山市怒江壩段(Baya-B)、臨滄市瀾滄江大橋上游(Baya-L)、瀾滄江景洪段(Baya-J)、紅河州河口縣段(Baya-H)6個河段為采樣點，每個點采集12尾，取肌肉組織置于 1.5 mL EP 管中，加入無水乙醇，于冰箱(-20 ℃)中保存?zhèn)溆?。采用?氯仿抽提法[13]提取巨魾DNA，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳確認后，貯存于冰箱(-20 ℃)中待用。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 本試驗中使用Du等[14]報道的兩對引物序列，其中Baya10號引物設計的目的片段為1244 bp，引物序列Baya10-F為GATCAGCACGACTCCCCTT，Baya10-R為CTTCTACGTGGG CTTTDGGT；Baya11號引物設計的目的片段為1444 bp，引物序列Baya11-F為CCAACCATCATRCTATTYCCA， Baya11-R為AGGC CTCTTTCGGTGGAYAA。通過兩對引物的擴增片段拼接后獲得巨魾的ND4基因全長序列。

1.2.2 巨魾ND4基因的PCR擴增及檢測 巨魾ND4基因的擴增在PCR擴增儀上進行。PCR反應體系(25 μL)包含：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL,正、反向引物(10 pmol/μL)各1.0 μL，DNA(80 ng/μL)1.0 μL，雙蒸餾水 9.5 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，利用梯度PCR進行引物退火溫度的確定[14]，72 ℃下延伸90 s， 共進行32個循環(huán)；最后在72 ℃下延伸6 min，4 ℃保存。利用10 g/L瓊脂糖進行凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中照相并保存。

1.2.3 目的片段回收、連接、轉(zhuǎn)化 擴增出目的條帶的PCR擴增產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離后在紫外儀中切下含有目的片段的凝膠。用DNA回收試劑盒回收，純化后克隆至大腸桿菌中，具體操作步驟參照回收試劑盒說明書。

1.2.4 單克隆檢測及測序 挑取單克隆，在含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，37 ℃下振蕩培養(yǎng)14～16 h。利用M13通用引物即M13-F(-47)(5′CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3′)和M13-R primer NEW(5′GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3′)進行菌液PCR，篩選出陽性單克隆，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將測序后獲得的72條ND4序列進行編號，分別為Baya-B1～B12、Baya-H1～H12、Baya-J1～J12、Baya-L1～L12、Baya-M1～M12、Baya-N1～N12。將72條ND4序列與參照物種ND4基因[14]進行比對拼接，對拼接好的序列用DNAMAN 5.0軟件進行比對，將比對的結(jié)果輸入MEGA 5.02軟件轉(zhuǎn)換為meg格式，并計算堿基含量、遺傳距離。采用 UPGMA中的Kimura 2-parameter 模型法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，利用DNASP 5.0軟件分析ND4序列的單倍型、核苷酸多樣性等。

2 結(jié)果與分析

2.1 巨魾ND4基因序列堿基組成及單倍型

經(jīng)PCR擴增、大腸桿菌克隆、測序，表明所有個體均獲得了堿基排列清晰、長度為1381 bp的ND4基因順序。利用DNASP軟件進行分析，在72條序列中有67種單倍型，并將序列遞交到GenBank(登錄號：MK529780～MK529844，MK546510～MK546511)，結(jié)果顯示，紅河河口群體中，4尾魚的單倍型相同，另外3尾魚的單倍型相同，其他5尾魚具有不同的單倍型；其他5個群體中60尾魚的單倍型各不相同，單倍型平均多樣性為0.967，核苷酸多樣性平均為0.032 6(表1)。

表1 巨魾6個群體間單倍型及核苷酸多樣性

Tab.1 Haploid and nucleotide diversities of six populations ofBagariusyarrelli

采用MEGA 5.02 軟件分析顯示，共有501個變異位點。序列的堿基組成情況見表2，其中6個群體中4種堿基A、G、T、C的平均含量分別為30.29%、14.47%、27.31%、27.93%，G的含量低于其他3種堿基的含量，其中A+T的含量為58.22%，G+C的含量為42.40%，A+T含量明顯高于G+C含量。

2.2 6個巨魾群體ND4基因的遺傳距離

用MEGA 5.02軟件中的雙參數(shù)法，通過轉(zhuǎn)換與顛換的比值計算6個群體之間的遺傳距離[15-16]，結(jié)果如表3所示。基于所有單倍型的6個群體間轉(zhuǎn)換/顛換 (Ts/Tv)及轉(zhuǎn)換+顛換(Ts+Tv)的遺傳距離平均值分別為6.769、0.106?；趩伪缎娃D(zhuǎn)換+顛換(Ts+Tv)的群體間遺傳距離為0.002～0.156，而基于單倍型轉(zhuǎn)換/顛換(Ts/Tv)的群體間遺傳距離為2.741～11.435。各單倍型的平均相對遺傳距離為0.098。

表2 巨魾 6個群體ND4基因序列堿基含量Tab.2 Basic contents of ND4 gene sequence of six populations of Bagarius yarrelli %

表3 基于巨魾ND4基因單倍型的6個群體遺傳距離Tab.3 Genetic distance of six populations of Bagarius yarrelli based on ND4 gene haplotype

注：下三角表示轉(zhuǎn)換與顛換之比(Ts/Tv)，上三角表示轉(zhuǎn)換與顛換之和(Ts+Tv)

Note: The data in lower triangle represent the transformation of the transformation ratio(Ts/Tv),and the data in upper triangular represent the transformation+change(Ts+Tv)

2.3 6個巨魾群體ND4基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

從圖1可見，采用MEGA 5.02 軟件中的UPGMA模型，以巨魾6個群體間的遺傳距離(轉(zhuǎn)換+顛換)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中，怒江壩群體(Baya-B)和怒江下游群體(Baya-N)巨魾先聚在一起后，再與瀾滄江上游群體(Baya-L)聚在一起，而紅河曼耗群體(Baya-M)、紅河河口群體(Baya-H)巨魾先聚在一起后，再與景洪群體(Baya-J)聚在一起。

以三線紋胸鮡Glyptothoraxtrilineatus(簡記為Gltr)(GenBank登錄號：JQ026262)和長絲黑鮡Gagatadolichonema(簡記為Gado)(GenBank登錄號：NC_021596)兩個物種為外群，對巨魾ND4基因中的67種單倍型進行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[17-18]，從圖2可以看出，系統(tǒng)發(fā)育樹分為兩大支，巨魾單獨聚為一支。

3 討論

3.1 巨魾ND4基因序列的堿基組成

本試驗中得到巨魾6個群體的72條線粒體ND4基因序列，ND4基因全序列長度為1381 bp，共獲得67個單倍型。對其堿基組成進行分析，結(jié)果顯示，6個群體中ND4基因序列中A、T、G、C 4個堿基的平均含量分別為30.29%、14.47%、27.31%、27.93%，A+T含量明顯高于C+G，同時可以看出，G 的含量明顯低于其他3種堿基的含量，說明這部分基因表現(xiàn)出很強的堿基組成偏向性，與脊椎動物線粒體DNA 的特點是一致的[8]。

3.2 6個巨魾群體間的遺傳距離

群體遺傳多樣性在遺傳距離上可以反映出來，本研究中6個巨魾基于單倍型的轉(zhuǎn)換+顛換(Ts+Tv)的不同群體間遺傳距離為0.002～0.156(表3)，其中紅河河口群體與曼耗群體之間的遺傳距離最小(0.002)，說明紅河河口群體與曼耗群體之間的分化程度較小，親緣關(guān)系較近；而瀾滄江群體與景洪群體之間的遺傳距離最大(0.156)，說明瀾滄江群體與景洪群體之間的分化程度較大，親緣關(guān)系較遠。

3.3 巨魾與其他魚的系統(tǒng)進化關(guān)系

在有外類群的情況下，所有巨魾魚聚在一起，形成一支(圖2)，這種結(jié)果與傳統(tǒng)的形態(tài)學分類基本相似。這一支又分為兩部分，置信度分別為80%和71%，大體上，怒江壩群體(Baya-B)、怒江下游群體(Baya-N)、瀾滄江上游群體(Baya-L)聚在一起，而景洪群體(Baya-J)、紅河河口群體(Baya-H)、曼耗群體(Baya-M)聚在一起，同6個群體間遺傳距離構(gòu)建聚類關(guān)系圖(圖1)結(jié)果相同，說明他們之間存在地域差異。但是有些群體出現(xiàn)交叉現(xiàn)象，這可能是受人為和環(huán)境因素的影響。另一支置信度為100%，又分為2 支，說明巨紋胸鮡屬和黑鮡屬有較近的親緣關(guān)系，與基于細胞色素氧化酶基因的巨魾系統(tǒng)進化研究結(jié)果一致[19]。

生物的遺傳多樣性水平是長期進化的產(chǎn)物，是評估生物資源現(xiàn)狀的一個重要參數(shù)[20]。遺傳多樣性的高低是評價物種對環(huán)境適應能力和物種進化潛力的重要依據(jù)，遺傳多樣性越豐富，物種對環(huán)境變化的適應能力越強，遺傳多樣性的貧乏會導致物種低的進化適應性，使得物種易于遭受生態(tài)環(huán)境改變的影響[21]。單倍型多樣性和核苷酸多樣性(>0.05)是衡量一個物種群體遺傳多樣的重要指標[22]。本研究中，瀾滄江上游群體、景洪群體單倍型多樣性和核苷酸多樣性都高，遺傳多樣性豐富；而怒江壩群體、紅河河口群體、紅河曼耗群體、怒江下游群體出現(xiàn)單倍型多樣性高、核苷酸多樣性低的模式(表1)，可能是群體受到瓶頸效應后種群迅速擴張所導致的結(jié)果，因為核苷酸多樣性的積累時間比單倍型多樣性的積累時間要漫長得多[23]。

綜上所述，3條河流巨魾群體的ND4基因序列具有豐富的多樣性，但是基于線粒體其他基因序列的分析結(jié)果如何，以及3條不同河流中巨魾對疾病的抵抗能力又如何，還有待后續(xù)進行相關(guān)研究。