歐利國，劉必林、2*

(1.上海海洋大學 海洋科學學院, 上海 201306； 2. 上海海洋大學 國家遠洋漁業(yè)工程技術研究中心，大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)教育部重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大洋漁業(yè)開發(fā)重點實驗室，上海 201306)

耳石形態(tài)學[1-3]是通過對耳石形態(tài)的大小和形狀的定量分析，進而研究魚類生物學特性。耳石形態(tài)學應用廣泛，如用于魚種識別[4-6]、攝食習性[7]和棲息環(huán)境[8-9]等。耳石形態(tài)學的研究方法主要有傳統(tǒng)形態(tài)測量法和幾何形態(tài)測量法。傳統(tǒng)形態(tài)測量法主要是分析耳石形態(tài)的度量特征[10]，用度量信息來了解耳石形態(tài)的變化，但耳石形態(tài)的變化差異往往由形狀變化所致，故用傳統(tǒng)形態(tài)測量法并不能很好地解釋耳石形狀信息的變化規(guī)律。幾何形態(tài)測量法摒棄了數(shù)據(jù)的不同源性和不可重復性[11]，能很好地提取和分析耳石形狀信息。幾何形態(tài)測量法包括橢圓傅立葉分析法和地標點法等，橢圓傅立葉分析法又稱輪廓法，是通過分析耳石形態(tài)輪廓并對耳石形態(tài)輪廓進行重建[11-12]，地標點法是對耳石形態(tài)選取有顯著特征的點并重構形態(tài)，可以取得較好的研究效果[11]。地標點法相對于橢圓傅立葉分析法具有同源性、易采集數(shù)據(jù)和易分析等優(yōu)點[13]。

近年來，國內對耳石形態(tài)學的研究主要集中在傳統(tǒng)形態(tài)測量法[10]，而幾何形態(tài)測量法的應用中以橢圓傅立葉分析法為主[14]，地標點法的研究應用較少。侯剛等[15-16]運用地標點法分別對4種白姑魚屬Pennahia和4種金線魚屬Nemipterus矢耳石進行了分類研究；姜濤等[17]基于地標法認為珠江口和九龍江口的鳳鱭Coiliamystus和七絲鱭C.grayii群體為不同地理群體；彭艷等[18]研究認為，嘉陵江不同江段蛇鮈Saurogobiodabryi耳石分為兩種類型且其形態(tài)存在顯著差異。相對于傳統(tǒng)形態(tài)測量法及橢圓傅立葉分析法，在耳石形態(tài)差異較大(輪廓不規(guī)則及突起較多等)的情況下[16]，以及利用耳石整體形態(tài)和聽溝形態(tài)相結合分析過程中[15]，地標點法對分析耳石形態(tài)信息具有很好的優(yōu)越性。國內應用地標點法對魚類耳石形態(tài)的種類鑒定較少，為此，本研究中以4種不同種的鲹科魚類[19](竹筴魚Trachurusjaponicus、短吻絲鲹Alectisciliaris、脂眼凹肩鲹Selarcrumenophthalmus、高體若鲹Caranxequula)矢耳石為例，利用地標點法研究其矢耳石形態(tài)差異，并分析地標點法對耳石形態(tài)信息的分類效果，旨在為豐富魚類耳石形態(tài)鑒定方法的多樣性和完善耳石形態(tài)學理論提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗魚于2014年3月采自中國南海東沙群島海域，其中短吻絲鲹采自(21°07′N, 115°29′E)海域，其他3種魚均采自(20°47′N, 115°07′E)海域，4種鲹科魚類樣品共108尾(表1)。試驗樣品在基礎生物學實驗室解凍后，通過皮尺測量和電子秤測量試驗樣品，測量叉長精確到1 mm，稱量體質量精確到1 g，并用鑷子摘取試驗樣品的左右耳石，對摘取后的耳石樣品除去包膜和黏液并清洗，再把耳石樣品放入盛有95%乙醇的離心管中保存待用。矢耳石形態(tài)術語參考相關研究[10, 20-21]。

表1 4種鲹科魚類采樣信息Tab.1 Sampling information of four species in Carangidae

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集 統(tǒng)一選取左耳石作為研究對象，從保存的離心管中取出耳石待酒精揮發(fā)后，耳石形態(tài)擺放原則以水平方向平行聽溝(裂溝)中部[4]進行擺放，使用體視顯微鏡(OLYMPUS SZ61)對耳石形態(tài)進行拍攝并采集圖像(圖1)，使用生物圖像處理軟件 Image-Pro Plus 6.0測量耳石形態(tài)學指標，精確到0.01 mm。

1.2.2 耳石形態(tài)地標點 在生物學的應用中，地標點的選取有3種類型[22]，參考國內相關研究[16]并結合本研究中的耳石形態(tài)特性，利用tpsDig 2軟件在采集完成的耳石形態(tài)二維圖像上建立8個地標點(圖1)，所有樣品的地標點數(shù)和順序保持一致，并對8個地標點進行分類(表2)，建立相應的坐標值數(shù)據(jù)文件。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用tpsSmall軟件對所獲得的地標點進行有效性檢驗。利用tpsRelw軟件求出耳石形態(tài)的平均形(mean shape)，然后進行相對扭曲(relative warps)，同時得出分析報告和求出相對扭曲得分，最后進行相對扭曲主成分分析(PCA)和利用相對扭曲得分對4種鲹科魚類耳石形態(tài)進行判別分析(Discriminant analysis, DA)。用tpsRegr軟件的薄板樣條分析法對耳石形態(tài)進行可視化處理，并計算出質心值(Centroid size，CS)，并對質心值進行對數(shù)轉換。對4種鲹科魚類耳石形態(tài)的質心值進行單因素方差分析，以比較4種鲹科魚類種間矢耳石形態(tài)質心值大小差異，單因素方差分析之前對4種鲹科魚類耳石形態(tài)的質心值數(shù)據(jù)進行K-S檢驗，判別是否符合正態(tài)分布和進行Levene方差齊性檢驗，并做耳石形態(tài)質心值箱線圖[23]。所有數(shù)據(jù)分析使用SPSS 20.0 和Excel 2016軟件完成。

表2 地標點的類型與定義Tab.2 Landmark types and definition

2 結果與分析

2.1 矢耳石形態(tài)地標點分析

利用tpsSmall軟件進行最小二乘準則回歸分析顯示，其切空間距離(y軸)和普式距離(x軸)的回歸系數(shù)為0.99，說明所選取的地標點是有效的。通過tpsRelw軟件對4種鲹科魚類矢耳石形態(tài)地標點數(shù)據(jù)文件進行分析，計算得到4種鲹科魚類矢耳石8個地標點的平均形(圖2-A)，并對4種鲹科魚類矢耳石108個樣品的所有地標點進行重疊(圖2-B)，可以明顯看出8個地標點各自的集散情況。相對扭曲分析顯示，4種鲹科魚類矢耳石形態(tài)的8個地標點，在相對扭曲時貢獻率最大的是地標點5，貢獻率為42.655%，其次為地標點4，貢獻率為35.853%(表3)。

表3 4種鲹科魚類不同地標點的相對扭曲貢獻率

Tab.3 Relative contribution of each landmark of four species in Carangidae

地標點landmark貢獻率%contribution rate地標點landmark貢獻率%contribution rate13.520542.65526.44861.69431.60075.850435.85382.380

2.2 矢耳石形態(tài)可視化分析

通過tpsRegr軟件對4種鲹科魚類矢耳石形態(tài)地標點進行可視化分析顯示，8個地標點生成的網(wǎng)格變形圖中，地標點矢量圖的網(wǎng)格變形中清楚地看出各個地標點在網(wǎng)格中的變化趨勢及變化程度(圖3-A)，而在地標點連線圖的網(wǎng)格變形中，可以直觀形象地看到可視化形成的矢耳石形態(tài)(圖3-B)，其可視化形態(tài)與實際耳石形態(tài)相似，可視化后的耳石形態(tài)具有種的特異性。

2.3 矢耳石形態(tài)質心值分析

通過對質心值進行對數(shù)轉換，4種鲹科魚類耳石形態(tài)質心值符合正態(tài)分布(P>0.05)，也通過了Levene方差齊性檢驗(P=0.079>0.05)。單因素方差分析顯示，4種鲹科魚類耳石質心值種間差異顯著(F=289.563，P<0.05)。從圖4可見，4種鲹科魚類耳石質心值的最大值比較中，脂眼凹肩鲹最大，短吻絲鲹最小。

2.4 主成分分析

相對扭曲主成分分析結果顯示，4種鲹科魚類矢耳石形態(tài)地標點主成分分析中共提取了12個主成分(表4)，其中，第1個主成分貢獻率為74.55%，第2個主成分貢獻率為11.16%，前兩個主成分的累計貢獻率達85.71%，很好地解釋了矢耳石形態(tài)變化特性。從圖5可見,第1主成分能很好地將4種鲹科魚類區(qū)分開，第2主成分僅能將竹筴魚與其他3種鲹科魚類區(qū)分開。

表4 相對扭曲得分的前12個主成分的特征值與貢獻率

Tab.4 Eigenvalues and contributions of the first twelve principal components of relative warps scores

主成分principal component特征值eigenvalue貢獻率/%contribution rate累計貢獻率/%cumulative contribution rate11.5296874.5574.5520.5918911.1685.7130.397545.0390.7440.332373.5294.2650.248131.9696.2360.220371.5597.7770.166640.8898.6680.136070.5999.2590.098410.3199.56100.083280.2299.78110.067980.1599.92120.048820.08100.00總方差 total variance3.92118

2.5 判別分析

判別分析顯示，4種鲹科魚類矢耳石形態(tài)的12個相對扭曲主成分得分，僅有7個指標(P<0.05)被納入判別函數(shù)中，分別是PC1、PC2、PC3、PC4、PC5、PC6、PC8。4種鲹科魚類判別分類函數(shù)如下(竹筴魚T，短吻絲鲹A，脂眼凹肩鲹S，高體若鲹C)：

T=-73.033PC1+166.479PC2-112.508PC3+32.551PC4-36.793PC5+50.560PC6+94.483PC8-12.993；

A=358.909PC1-67.372PC2+75.309PC3-33.236PC4+86.212PC5-254.708PC6-11.760PC8-49.402；

S=-132.724PC1-24.518PC2+34.020PC3-10.570PC4-2.448PC5+88.791PC6-9.226PC8-8.681；

C=49.915PC1+5.346PC2-219.315PC3+102.969PC4-157.967PC5+6.531PC6-110.068PC8-16.538。

判別分析結果顯示，4種鲹科魚類的判別分析中逐步判別和交互檢驗的成功率平均值均為100%(表5)。4種鲹科魚類的判別函數(shù)圖(圖6)區(qū)分效果較好，判別函數(shù)1可以將短吻絲鲹和高體若鲹與其他兩種魚區(qū)分開，而判別函數(shù)2則可以把竹筴魚和高體若鲹與其他兩種魚區(qū)分開。判別函數(shù)1解釋了4種鲹科魚類矢耳石形態(tài)總變異的81.8%。

3 討論

3.1 選取地標點對耳石形態(tài)信息的影響

傳統(tǒng)形態(tài)測量法對形態(tài)信息的提取能力有限，幾何形態(tài)測量法[13]的發(fā)展彌補了傳統(tǒng)形態(tài)測量法的不足，幾何形態(tài)測量法為生物分類學和系統(tǒng)發(fā)育學提供強有力的研究手段[24]。地標點法[13]以定量的分析方式對耳石形態(tài)差異進行描述，通過對地標點位置的確定有助于分析和提取耳石形態(tài)信息數(shù)據(jù)，并進一步解釋耳石形態(tài)的變異和種間的特異性。耳石形態(tài)二維平面上的各個地標點均是由一組坐標值組成[13]，在進行形態(tài)分析時，選取具有代表性的地標點尤其重要。

本研究中根據(jù)4種鲹科魚類矢耳石形態(tài)的平均形和重疊地標點圖(圖2)可以看出，地標點4和地標點5相對其他地標點，其地標點較為集中，離散程度小。在相對扭曲時，地標點5貢獻率最大，其次為地標點4，兩個地標點占了全部貢獻率的78.508%，說明在選取的地標點中這兩個地標點對耳石形態(tài)信息的分析和提取中作用顯著。而Ⅰ型地標點貢獻率為42.655%，Ⅲ型地標點為45.047%，也說明地標點選取的重要性。選取地標點對耳石形態(tài)信息的影響在其他研究也有類似的結果，如在白姑魚屬Pennahia耳石形態(tài)分析中，其耳石聽溝頸部交叉點兩個地標點貢獻率達83.01%，對形態(tài)識別起到非常重要的作用[15]；金線魚屬Nemipterus耳石形態(tài)研究中其Ⅰ型地標點和Ⅲ型地標點對耳石形態(tài)區(qū)別也有較大作用[16]。不同種魚類耳石形態(tài)在地標點的選取中[15-16,18]，因其Ⅰ型地標點是耳石形態(tài)中不同部分間的交點，如基葉與翼葉的交點等，所以Ⅰ型地標點在選取過程中容易被準確定位。而Ⅰ型地標點貢獻率較高[15-16,18]，也較為穩(wěn)定，具有很好的代表性，對耳石形態(tài)地表點法分析產(chǎn)生重要的影響。

表5 4種鲹科魚類耳石的判別分析結果(逐步判別分析、交互檢驗分析)

Tab.5 Discriminant analysis results of otolith of four species in Carangidae (stepwise discriminant analysis and cross validation analysis)

判別前種類predicted species 判別后種類 discriminated species竹筴魚短吻絲鲹脂眼凹肩鲹高體若鲹樣品數(shù)量/ind.sample size竹筴魚Trachurus japonicus18(100%)00018短吻絲鲹Alectis ciliaris024(100%)0024脂眼凹肩鲹Selar crumenophthalmus0058(100%)058高體若鲹Caranx equula0008(100%)8

筆者認為，在地標點法分析中選取地標點應結合其耳石形態(tài)特異性選取具有代表性的點，才能更好地提高對耳石形態(tài)信息的提取和識別魚種的效果。如4種白姑魚[15]和4種金線魚[16]均采用其耳石整體形態(tài)和聽溝形態(tài)的地標點相結合分析耳石形態(tài)差異，由于其白姑魚屬和金線魚屬耳石整體形態(tài)屬內差異較小且較為相似，所以需要結合其聽溝形態(tài)地標點進行分析，以便達到更好的分析效果。本研究中4種鲹科魚類雖為同科魚類但不同屬，其耳石形態(tài)差異較大，通過耳石整體形態(tài)的地標點分析能達到較好的分類效果。

3.2 地標點法對耳石形態(tài)的可視化效果

4種鲹科魚類耳石形態(tài)特征差異明顯，具有鮮明的種的特異性。竹筴魚矢耳石形態(tài)呈長橢圓形，基葉發(fā)達，有翼葉發(fā)育；短吻絲鲹矢耳石形態(tài)略似手寫體的阿拉伯數(shù)字“9”，基葉發(fā)達且寬厚，翼葉發(fā)育明顯；脂眼凹肩鲹矢耳石形態(tài)呈四邊形，基葉發(fā)育明顯，有翼葉發(fā)育且呈小三角形；高體若鲹矢耳石形態(tài)呈長橢圓形，基葉發(fā)達，有翼葉發(fā)育，其翼葉發(fā)育呈三角形。

本研究中地標點是沿著耳石輪廓順時針選取具有代表性的地標點，并通過薄板樣條分析[25]得到4種鲹科魚類耳石形態(tài)可視化的網(wǎng)格變形圖(地標點矢量圖和地標點連線圖)，基于二維平面的耳石形態(tài)地標點位置可以觀察出，地標點連線圖(圖3-B)中耳石形態(tài)的網(wǎng)格變形過程中其耳石形態(tài)變化具有種的特異性，使得地標點法分析更為直觀。此外，可以從地標點矢量圖(圖3-A)中直接看出，耳石形態(tài)地標點在網(wǎng)格上的變化和差異。通過4種鲹科魚類耳石形態(tài)地標點的網(wǎng)格變形圖可以初步進行種類鑒定，要更進一步鑒定和確定魚種需要結合主成分分析和判別分析進行準確識別。

本研究中從質心值的箱線圖(圖4)可以直觀地看出，4種鲹科魚類耳石形態(tài)質心值的種間變化，即通過地標點法利用質心值分析4種鲹科魚類耳石形態(tài)大小關系[23,26]，4種鲹科魚類耳石形態(tài)最大值由大到小依次為脂眼凹肩鲹>竹筴魚>高體若鲹>短吻絲鲹。地標點法的質心值與傳統(tǒng)形態(tài)測量法的度量值不同，通過地標點法得到的質心值在耳石形態(tài)信息提取上更為全面，本研究中的地標點是沿著耳石輪廓順時針提取形態(tài)信息，即包含了耳石形態(tài)8個地標點在二維平面的形態(tài)信息，使得對4種鲹科魚類耳石形態(tài)的分析更為直觀形象。

3.3 地標點法對耳石形態(tài)的分類識別效果

本研究中在相對扭曲主成分分析中，4種鲹科魚類矢耳石形態(tài)地標點提取的前兩個主成分信息較好，矢耳石形態(tài)信息的相對扭曲主成分降維分析效果顯著。同時，前兩個主成分信息很好地解釋了矢耳石形態(tài)信息變化，也印證了選取具有代表性的地標點對耳石形態(tài)信息多元統(tǒng)計分析的重要性。此外，根據(jù)主成分散點圖(圖5)可以看出，第1個主成分在耳石形態(tài)信息的降維過程中起到了重要作用。從4種鲹科魚類的判別函數(shù)圖(圖6)可以看出，判別函數(shù)1可以將短吻絲鲹和高體若鲹與其他兩種鲹科區(qū)分開，判別函數(shù)2則把竹筴魚和高體若鲹與另外兩種魚區(qū)分開。本研究的判別分析中，逐步判別和交互檢驗對4種鲹科魚類的判別成功率平均值均為100%，識別效果均很好。與本研究相似的分類研究結果有鳳鱭Coiliamystus和七絲鱭C.grayii兩種魚的不同群體判別成功率平均值也為100%[17]；4種金線魚的平均判別成功率為89.8%[16]，低于本研究的判別成功率。這表明,本研究中利用地標點法對4種鲹科魚類耳石形態(tài)識別效果明顯。但也存在應用地標點法對生物分類識別效果較差的情況，馮波等[27]研究短吻鲾Leiognathusbrevirostris不同地理群體，采用傳統(tǒng)形態(tài)測量法和地標點法進行比較分析，其分析效果是傳統(tǒng)形態(tài)測量法優(yōu)于地標點法，原因可能是地標點選取不當造成的。選取具有同源性的地標點[28]，即選取地標點要具有代表性，這不僅對形態(tài)信息分析產(chǎn)生影響，而且也最終影響到種類鑒定分析效果。

隨著幾何形態(tài)測量法的不斷深入和完善[29-30]，不僅開發(fā)出許多形態(tài)測量應用軟件[11]，而且促進了大批研究人員從事該方面的研究，使得基于形態(tài)信息的研究方法在生物領域等中也得到了應用和推廣[31]。地標點法在耳石形態(tài)學的應用中能有效地對耳石形態(tài)信息進行提取，對耳石形態(tài)的種類鑒定、群體識別應用具有十分重要意義，也為識別耳石形態(tài)的自動分類提供了基礎，地標點法對耳石形態(tài)信息的分析，使得耳石形態(tài)中的一些信息特征能夠被轉換成幾何指標數(shù)據(jù)，而這些幾何指標數(shù)據(jù)的構成和完善是將來計算機自動處理和識別分析魚種的重要手段之一，地標點法的應用不僅為完善耳石形態(tài)學的研究提供了強有力的研究手段，而且為魚類系統(tǒng)分類學提供了多樣的研究方法。