高慶和，晏斌，劉煜，劉勝京，付建華

(中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院，北京 100091)

精液分析是評估男性生育能力的基礎(chǔ)檢查，包括精液體積、精子濃度、精子存活率、前向運動精子百分率以及精子形態(tài)學分析等，檢測結(jié)果可為臨床醫(yī)生提供初步的診斷依據(jù)[1]。但精液分析不能準確預測由于精子質(zhì)量變化而產(chǎn)生的影響，因此有必要尋找其他的檢測指標，來提高男性生育的預測和管理[2]。隨著對男性不育癥病因及機制的深入研究，精子DNA碎片(Sperm DNA fragmentation，SDF)檢測可能成為評價男性生育能力的重要手段，精子DNA碎片指數(shù)(DNA fragmentation index，DFI)開始為患者的病因診斷提供新依據(jù)。雖然其在男性不育癥的臨床診斷中并未常規(guī)使用，但SDF檢測的價值已被美國泌尿外科學會和歐洲泌尿外科學會的相關(guān)指南承認。轉(zhuǎn)化醫(yī)學學會(The Society for Translational Medicine，TSM)在2017年發(fā)表了《男性不育癥精子DNA碎片檢測臨床實踐指南》(以下簡稱《指南》)，介紹了SDF的檢測方法、SDF檢測適應癥、DFI結(jié)果分析等[3]。本文通過對《指南》進行解讀，旨在指導臨床醫(yī)師和檢驗人員規(guī)范SDF的檢測和應用，尤其是對DFI結(jié)果的客觀分析。

一、SDF的檢測

《指南》指出，精子DNA損傷的機制尚不清楚，存在多種SDF檢測方法。在實驗室中廣泛使用并將其作為臨床指標應用于男性生育評估之前，需要在方法學上對SDF檢測進行規(guī)范，實現(xiàn)SDF檢測的標準化。

1.SDF的檢測方法：SDF檢測一般分為直接和間接檢測兩類方法。直接測定法通過直接使用探針和染料來測量。間接測定法既測量現(xiàn)有的斷裂，也可以測量DNA對變性的敏感性。目前SDF檢測有8種方法[4]，其中末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標記(TUNEL)、精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析(SCSA)和精子染色質(zhì)彌散試驗(SCD)是3種最常用的檢測方法。(1)TUNEL：利用熒光標記的核苷酸片段檢測DNA的“Nicks”或游離端，該方法通過使用流式細胞術(shù)或熒光顯微鏡對dUTP通過酶反應進入單鏈或雙鏈DNA斷裂進行定量。(2)SCSA：基于流式細胞術(shù)的檢測方法，用于評估吖啶橙色染色到DNA斷裂的大量細胞，在精子DNA的溫和酸變性之后，核酸選擇性陽離子熒光染料與產(chǎn)生綠色熒光的雙鏈DNA或產(chǎn)生紅色熒光的單鏈DNA結(jié)合，DNA變性的程度是通過測量從綠色到紅色熒光的異色移位來確定的。(3)SCD：也被稱為光暈測試，即具有片斷DNA的精子在酸變性和去除核蛋白后不會產(chǎn)生在具有非片斷DNA精子中觀察到的分散DNA環(huán)的特征光暈，利用顯微鏡去觀察光暈的有無和大小從而判斷精子DNA的完整性。不管使用哪種檢測方法，研究表明SDF檢測在評估精子DNA損傷和生育潛力方面具有重要價值[5]。

2.SDF的檢測要求：文獻報道新鮮精液最常用于SDF檢測(表1，C級建議)，加工處理后的精液會對檢測結(jié)果有一定影響。體外受精(IVF)/卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)的精子制備程序會造成精子DNA損傷。密度梯度離心法(DGC)是輔助生殖技術(shù)(ART)前一種常見的精子制備程序，雖然DGC使得精子活動率改善，但DGC后精子DFI從15%顯著增加到25%[6]，從而導致較低的妊娠率[7]。但也有研究得出相反的觀點，顯示在DGC后DNA受損的精子比例減少了22%～47%[8]。此外，精子細胞上游(swim-up)后，精子SDF與受精率、著床率和妊娠率之間并沒有明顯的相關(guān)性[9]。因此，精液處理對SDF的影響尚不確定，需要進一步的研究，目前的證據(jù)尚不支持在SDF檢測中使用處理后的精液來預測ART結(jié)局。

3.禁欲時間對SDF結(jié)果的影響：采集精液標本前的禁欲時間對SDF結(jié)果有一定影響(表1，C級建議)。與禁欲時間較長的患者相比，禁欲1 d的SDF顯著降低，縮短禁欲時間已被建議作為治療高SDF的一種方法[10]。雖然最佳的禁欲時間尚未確定，《指南》建議在精液采集前2～3 d禁欲可能會減少SDF個體內(nèi)和個體間差異對測試結(jié)果的影響。與正常對照組相比，具有高SDF的不育男性精液樣本中活性氧(ROS)含量較高[11]?！吨改稀吠扑]縮短精子培養(yǎng)時間、在室溫下保存以及向培養(yǎng)基中添加抗氧化劑/低溫保護劑等策略以減少對SDF的影響。

4.SDF檢測的標準化：具有嚴格質(zhì)量控制的標準方案對于SDF檢測結(jié)果的可靠性是必不可少的(表1，B-C級建議)。目前，SDF檢測的不足之處即DNA損傷的性質(zhì)和類型是未知的。但通過反映樣本的整體質(zhì)量和精子DNA的性質(zhì)，這些測試是相互關(guān)聯(lián)的，并且可能指向共同的損傷來源。研究顯示，當使用相同的儀器在標準化的分析條件下獨立分析同一組精液樣品時，兩個實驗室之間的SDF結(jié)果具有高度相關(guān)性[12]。同樣，經(jīng)驗豐富的技術(shù)人員使用標準化方案對精液樣品SDF進行比較測量，也顯示出實驗室之間高度可靠的結(jié)果[13]。同時，流式細胞術(shù)的應用允許在相對較短的時間內(nèi)分析數(shù)千個細胞，大大增加了SDF檢測的可靠性[14]。與其他技術(shù)中使用光學或熒光顯微鏡相比，TUNEL和SCSA中流式細胞術(shù)的加入減少了觀察者內(nèi)和觀察者間的變異性。在SDF檢測中，SCSA、TUNEL、SCD和彗星實驗(COMET Assay)具有文獻報道的標準化方案[15-18]。因此，SDF檢測的標準化，需要在專業(yè)實驗室通過標準方案和質(zhì)量控制才能確定檢測的可靠性。

表1 SDF的檢測要求

二、SDF檢測的臨床適應證

盡管精子DNA完整性在人類生殖中的重要作用已被廣泛研究，但SDF檢測的臨床適應證尚不明確，《指南》根據(jù)現(xiàn)有證據(jù)支持的試驗，在臨床實踐中為SDF檢測提出具體的適應證。

1.精索靜脈曲張患者：精索靜脈曲張是男性不育的常見原因，精索靜脈結(jié)扎術(shù)已被證明能顯著改善精液參數(shù)，改善自然妊娠結(jié)局[19]。使用傳統(tǒng)的精液分析作為手術(shù)治療獲益與否的評價指標是不足的[20]，在發(fā)現(xiàn)SDF與精索靜脈曲張顯著正相關(guān)后，人們開始關(guān)注SDF檢測，關(guān)注精索靜脈曲張患者的SDF數(shù)值。在包括16個病例對照研究的文獻綜述中，Zini等[21]指出精索靜脈曲張男性的SDF高于對照組，表明精索靜脈曲張與DNA損傷有關(guān)。Esteves等[22]的一項多中心研究評估各種病因的SDF，發(fā)現(xiàn)男性精索靜脈曲張患者SDF發(fā)生率最高[(35.7±18.3)%]。精索靜脈曲張與SDF之間的相關(guān)性，在精索靜脈結(jié)扎術(shù)后精子DNA損傷改善中得到進一步驗證。Zini等[21]報道12項研究中共511例患者精索靜脈結(jié)扎術(shù)后SDF降低。有Meta分析表明，精索靜脈結(jié)扎術(shù)提高了精子的完整性，與未治療相比平均差異3.37%[95%CI(-4.09，-2.65)，P<0.000 01][23]。

SDF與臨床2～3級精索靜脈曲張之間的關(guān)系得到了各種研究的證據(jù)支持，Sadek等[24]報道，只有3級精索靜脈曲張患者術(shù)后SDF有統(tǒng)計學上的顯著降低。Ni等[25]報道，手術(shù)修復后2級和3級精索靜脈曲張患者的SDF均減少。因此，SDF檢測推薦用于常規(guī)精液參數(shù)正常的2～3級精索靜脈曲張患者(表2，C級推薦)。然而，目前還沒有足夠的證據(jù)來證明SDF檢測在低度精索靜脈曲張中的臨床應用，因此需要進一步的研究來闡明SDF在1級精索靜脈曲張中的應用價值。一項研究評估了482例1～3級的精索靜脈曲張不育癥患者，術(shù)后精液參數(shù)均有統(tǒng)計學意義的改善，而且低度精索靜脈曲張患者在手術(shù)后獲得了與3級精索靜脈曲張患者相似的自然妊娠結(jié)局[26]。因此，《指南》推薦SDF檢測用于精液參數(shù)臨界或異常的1級精索靜脈曲張患者(表2，C級推薦)。

SDF與精索靜脈曲張之間具有相關(guān)性，以及精索靜脈曲張患者術(shù)后SDF改善，支持SDF檢測在精索靜脈曲張患者中應用。SDF檢測在2～3級精索靜脈曲張患者中的應用較為明確，在1級精索靜脈曲張患者中的應用仍需進一步的研究。

2.不明原因不育、宮腔內(nèi)人工授精(IUI)失敗或反復流產(chǎn)的患者：不明原因不育癥約占不育夫婦的10%～30%[27]。男性因素可能存在精子DNA完整性受損，而精液參數(shù)正常[28]，這也證明傳統(tǒng)精液分析的局限性。有25%～40%精液參數(shù)正常的不育男性出現(xiàn)DFI大于20%～30%。Olezczuk等[29]將119名不明原因不育癥的男性與95名已證實生育能力的男性進行比較，發(fā)現(xiàn)不明原因不育癥患者DFI在30%以上的為17.7%，而已證實生育能力的男性為10.5%(P=0.005)。SDF與IUI失敗相關(guān)，Duran等[30]評估154個IUI周期的精液樣本，在IUI失敗的周期中SDF水平明顯升高。Bungum等[28]研究稱，DFI>30%的患者生化妊娠(3% vs. 24%)、臨床妊娠(3% vs. 23.7%)和分娩率(1% vs. 19%)較DFI<30%的患者顯著降低。SDF與反復流產(chǎn)相關(guān)，Carlini等[31]發(fā)現(xiàn)盡管精液參數(shù)正常，反復流產(chǎn)組DFI[(18.8±7.0)%]高于生育對照組[(12.8±5.3)%]，與不育夫婦相似[(20.8±8.9)%]，反復流產(chǎn)事件數(shù)與DFI升高呈顯著正相關(guān)(r=0.20，P<0.05)。因此，不明原因不育、IUI失敗和反復流產(chǎn)的夫婦應該進行SDF檢測，同時實施可能的干預措施來減少DFI(表2，C級建議)。

3.IVF和/或ICSI失敗的患者：SDF與IVF妊娠率之間具有顯著關(guān)系，Zini等[32]評估了9項IVF研究，發(fā)現(xiàn)高SDF患者的妊娠率較低，合并優(yōu)勢比為1.57[95%CI(1.18-2.07)，P<0.05]；未發(fā)現(xiàn)SDF和ICSI妊娠率之間的顯著關(guān)聯(lián)，合并優(yōu)勢比為1.14[95%CI(0.86-1.54)]。Zhao等[33]在2 756對夫婦的薈萃分析中發(fā)現(xiàn)，高SDF患者IVF妊娠率較低，但ICSI妊娠率沒有明顯影響，這可能與ICSI過程是將精子直接注入卵母細胞，精子受到較少的氧化應激有關(guān)，同時質(zhì)量較好的卵母細胞可能更有能力修復精子中的損傷。接受IVF和ICSI的患者，SDF與活產(chǎn)率之間具有相關(guān)性，有薈萃分析顯示，低SDF的男性活產(chǎn)率高于高SDF的男性[OR=1.17，95%CI(1.07-1.28)，P=0.000 5][34]。另有研究顯示低SDF的男性活產(chǎn)率明顯較高，IVF和ICSI風險比分別為1.27[95%CI(1.05-1.52)，P=0.01]和1.11[95%CI(1.00-1.23)，P=0.04][35]。

在ART之前SDF檢測常規(guī)應用存在爭議，這與治療策略對ART結(jié)局的不確定影響有關(guān)，但支持對高SDF患者進行干預的有效性證據(jù)仍在不斷發(fā)展。Bradley等[36]發(fā)現(xiàn)睪丸抽吸精子的活產(chǎn)率(49.8%)、卵胞漿內(nèi)形態(tài)選擇后精子注射的活產(chǎn)率(28.7%)和生理性ICSI活產(chǎn)率(38.5%)高于未干預組(24.2%)。在ICSI中使用從睪丸獲得的精子是一種合理的策略，這與精子DNA損傷發(fā)生在附睪運輸過程中有關(guān)[37]。研究證明，高SDF、少精子癥或反復IVF失敗的男性中，采用睪丸取精是有益的(表2，B-C級建議)。

《指南》建議，SDF檢測適用于反復出現(xiàn)輔助生殖失敗的患者，在IVF或ICSI中的檢測應該更早(表2，C級建議)。自然妊娠和ART可以通過SDF檢測來預測結(jié)局，反復流產(chǎn)和ART失敗與SDF升高有關(guān)。SDF檢測的結(jié)果可為不育夫婦選擇成功率高的ART方案提供依據(jù)。

4.具有危險因素的男性患者：SDF檢測應提供給具有危險因素(主要指吸煙、肥胖等)的男性不育癥患者，無論精液參數(shù)是否正常(表2，C級推薦)。氧化應激誘導的SDF與男性不育癥患者的生活方式有潛在關(guān)系，通過改變這些危險因素，男性SDF檢測值可以改善。(1)吸煙：吸煙對常規(guī)精液參數(shù)、精子受精能力和不育風險有不利影響[38]。Elshal等[39]研究顯示，不育吸煙者的SDF顯著高于不吸煙者。SDF程度與精液參數(shù)惡化之間存在顯著的負相關(guān)。(2)肥胖：肥胖與生育能力低下有關(guān)，體重指數(shù)(BMI)增加和生育能力之間具有相應關(guān)系[40]。Kort等[41]評估了520對不育夫婦，發(fā)現(xiàn)男性BMI與SDF呈正相關(guān)，平均SDF從BMI正常男性的19.9%上升到肥胖男性的27.0%。因此，SDF檢測應該對具有危險因素的不育男性提供。SDF與生活方式之間的關(guān)聯(lián)使SDF檢測成為識別高?；颊吆捅O(jiān)測干預反應的理想工具，SDF檢測也有助于督促患者生活方式的改變。

表2 SDF檢測的適應證

注：根據(jù)證據(jù)質(zhì)量給出的建議等級：A級，基于質(zhì)量良好且與至少一個隨機試驗一致的臨床研究；B級，基于設(shè)計良好的研究(前瞻性，隊列)，但沒有良好的隨機臨床試驗；C級，基于質(zhì)量較差的研究(回顧性，病例系列，專家意見)。修改自牛津循證醫(yī)學中心。

三、SDF閾值的作用

SDF閾值可反映生殖結(jié)局的概率(表1，B-C級建議)，缺乏SDF檢測的標準值是其不足之處。由于生殖涉及男女雙方的多種因素，SDF閾值不能完全評估生殖結(jié)局。目前DFI實驗室參考值一般如下：DFI≤15%表示精子DNA完整性好；15%30%與自然受孕和IUI中的陰性妊娠結(jié)局一致。ART的成功率隨著DFI升高而下降，當DFI達到20%～25%可能會出現(xiàn)不育問題[42]。然而，并不排除高DFI有成功受孕的可能性。因此《指南》指出SDF檢測結(jié)果應作為反映妊娠概率的統(tǒng)計值，根據(jù)具體臨床情況并考慮其他混雜因素調(diào)整該值是合理的，較高的DFI為不良生殖結(jié)局提供了一個可能的解釋。

四、討論

《指南》指出，隨著ART的快速發(fā)展，男性不育癥患者可以通過ICSI繁衍后代，卻沒有解釋引起男性不育癥的原因，忽視了對男性生育能力的評估。因此，過去幾十年男性不育癥的研究人員轉(zhuǎn)向了精子內(nèi)部的檢測，發(fā)現(xiàn)精子DNA完整性對人類生殖具有重要作用[43-44]。

SDF能否被視為影響男性生育能力的一個獨立致病因素，SDF檢測是否應作為一項常規(guī)檢測用以評價精子質(zhì)量和預測男性生育能力仍然具有爭議，但是針對SDF的大部分研究都清晰表明，SDF與人類生殖存在密切聯(lián)系，SDF目前在臨床中的可用性越來越高。《指南》對臨床醫(yī)師提出了具體的建議，SDF檢測適應于精索靜脈曲張、不明原因不育或IUI失敗或反復流產(chǎn)、IVF和/或ICSI失敗、生活方式具有危險因素的男性不育患者。同時，《指南》對SDF檢測的規(guī)范性給出了具體要求，在精子采集和質(zhì)量控制等方面確保SDF檢測的準確性。

精子的產(chǎn)生是一個多因素參與協(xié)調(diào)的漫長過程，任何過程受到干擾或者損傷都有可能使精子DNA染色體結(jié)構(gòu)異常，因此SDF產(chǎn)生的具體機制尚不明確。為減少異常SDF對生育的影響，口服抗氧化劑、精索靜脈曲張修復、縮短禁欲時間、精子選擇技術(shù)以及睪丸抽吸精子用于ICSI的嘗試都取得了不同程度的進展。因此，SDF檢測應與傳統(tǒng)精液分析一起用于男性不育癥的評估中，進一步的研究有助于SDF檢測在臨床實踐中發(fā)揮的更大作用。