王喜良，郝冬梅，張金艷，侯開波，于月新

(北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，沈陽 110016)

患者，女，出生時(shí)全身無體毛、睫毛及頭發(fā)，雙手及雙腳皮膚過度角化，指甲發(fā)育不良，無汗毛孔，正常排汗。有汗型外胚層發(fā)育不良(hidrotic ectodermal dysplasia，HED)家族史，基因型為GJB6(NM_006783.4，c.263C>T雜合突變，p.A88V)。2014年結(jié)婚，婚后同居生活，性生活正常，2016年孕5月行產(chǎn)前診斷，因胎兒為受累胎兒而引產(chǎn)。2017年來院要求行胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(PGT)。

抽取患者夫婦及患者父母外周血，提取DNA，高通量測序。以GJB6基因(NM_006783.4 chr13：20796101-20806534反向轉(zhuǎn)錄)編碼區(qū)及外顯子-內(nèi)含子交界為目標(biāo)區(qū)域，并在基因上下游選擇若干單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)記，檢測SNP位點(diǎn)基因型，選擇其中相應(yīng)位點(diǎn)構(gòu)建單體型，進(jìn)行連鎖分析。采用短效長方案進(jìn)行促排卵，獲得的卵子采用卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)方式人工授精，胚胎培養(yǎng)，發(fā)育到囊胚時(shí)活檢4～10個(gè)滋養(yǎng)層細(xì)胞，活檢后的胚胎采用玻璃化冷凍法進(jìn)行冷凍保存。對(duì)活檢的滋養(yǎng)層細(xì)胞采用多重置換擴(kuò)增方法(MDA)進(jìn)行全基因組擴(kuò)增。采用高通量測序技術(shù)，對(duì)染色體非整倍體、微缺失、微重復(fù)進(jìn)行檢測，分辨率為4 Mb。以GJB6基因編碼區(qū)為目標(biāo)區(qū)域，并在基因上下游選擇若干SNP位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)記，檢測SNP基因型，選擇其中相應(yīng)位點(diǎn)構(gòu)建單體型。采用一代測序技術(shù)對(duì)致病變異位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。選擇正常胚胎行復(fù)蘇移植。妊娠16～18周抽取羊水進(jìn)行一代測序驗(yàn)證。

通過SNP連鎖成功構(gòu)建了單體型?；颊叽倥奴@得了3個(gè)卵子，ICSI后均正常受精，2個(gè)胚胎發(fā)育到囊胚，進(jìn)行活檢。1枚胚胎非整倍體檢測結(jié)果異常，1枚胚胎非整倍體檢測結(jié)果正常。對(duì)非整倍體結(jié)果正常的胚胎進(jìn)行單體型分析，結(jié)果正常。進(jìn)行一代驗(yàn)證，結(jié)果正常，證明胚胎未攜帶致病變異(具體檢測結(jié)果見表1)。

表1 胚胎檢測結(jié)果

胚胎移植后第14天血HCG值為359 U/L，4周見胎心、胎芽，獲得臨床妊娠。妊娠16周抽取羊水，產(chǎn)前診斷結(jié)果顯示胎兒未攜帶致病變異。妊娠40+2周，剖宮產(chǎn)獲得一名女嬰，體重3 200 g，體檢未見明顯異常。

討 論

人體皮膚由胚胎的兩個(gè)胚層發(fā)育而來，其中外胚層發(fā)育成表皮及附屬器官。外胚層發(fā)育不良可導(dǎo)致外胚層來源的組織結(jié)構(gòu)或功能異常。HED(OMIM 129500)為一種常染色體顯性遺傳病[1]，臨床表現(xiàn)主要為毛發(fā)缺陷、甲營養(yǎng)不良和掌跖角化三聯(lián)征，這些癥狀會(huì)對(duì)患者的身體和心理造成嚴(yán)重的不良影響[2-4]。

該病的致病基因?yàn)镚JB6(gap junction beta 6)，編碼縫隙連接蛋白Cx30。Cx30為一種縫隙連接通道蛋白，其變異可引起多種皮膚和其他器官的疾病[5-6]。目前發(fā)現(xiàn)的GJB6致病變異有4種，包括G11R、V37E、D50N和A88V，這4種變異都會(huì)造成氨基酸替換[7]。本病例中的患者經(jīng)檢測即為p.A88V變異。研究表明，p.A88V的改變可以使角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)的ATP滲出到細(xì)胞外的基質(zhì)中，ATP水平增高作為一個(gè)旁分泌信號(hào)可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增生和分化，從而引起HED的相應(yīng)臨床表現(xiàn)[8]。

常染色體顯性遺傳病行產(chǎn)前診斷有一半的患者要行流產(chǎn)或引產(chǎn)，會(huì)對(duì)孕婦及家庭帶來極大的傷害。近年來隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，PGT技術(shù)逐漸應(yīng)用。PGT使用分子遺傳學(xué)技術(shù)，在體外培養(yǎng)的胚胎階段即可獲得胚胎的遺傳特性，然后挑選不攜帶已知致病變異的胚胎移植。

本病例采用PGT技術(shù)成功阻斷了1例HED患者的垂直傳遞，幫助患者家庭生育了一名健康的孩子，對(duì)家庭和社會(huì)都具有非常大的意義。