梁雨，曾彬，于婉瑩，李翠

(唐山市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，唐山 063000)

不孕不育癥是繼惡性腫瘤、心血管疾病之后第三大危害人類健康的疾病。資料顯示，全世界范圍內(nèi)約15%的已婚夫婦受到生殖健康問題的困擾，而我國已婚夫婦中不能生育率占比約為12.5%[1-2]。體外受精(IVF)是輔助生殖技術(shù)的核心部分，亦是近代醫(yī)學(xué)進程中治療不孕癥的最重要方式之一。但該種方式治療現(xiàn)狀并不樂觀，據(jù)歐洲IVF檢測協(xié)會(EIM)公布的數(shù)據(jù)顯示，IVF周期妊娠率低于20%[3]。絕大多數(shù)接受治療的患者需要承受反復(fù)受精失敗、生化妊娠等不良結(jié)局，不僅對其造成巨大的經(jīng)濟壓力還會影響身心健康。目前，人們致力于研究IVF不良結(jié)局致病原因，期望通過早期干預(yù)來防治不良結(jié)局的發(fā)生。有研究表明，孕婦外周血液中NK細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cell，Treg)細(xì)胞數(shù)目和功能上調(diào)能夠幫助維持妊娠活動的正常進展[4]。而最新的觀點表示，NK細(xì)胞數(shù)目和功能變化不僅與輔助生殖技術(shù)不良治療結(jié)局相關(guān)，還會參與到生殖失敗的發(fā)病機制。資料顯示，隨著外周血NK細(xì)胞數(shù)目和活性的增加IVF周期胚胎植入率明顯下降，而Treg細(xì)胞特征標(biāo)志物叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子P3(forkhead box P3，F(xiàn)oxP3)表達也顯著減少[5]?；诖耍狙芯糠治鐾庵苎蠳K細(xì)胞通路調(diào)節(jié)Foxp3表達對IVF的影響，為IVF不良結(jié)局預(yù)防和治療提供指導(dǎo)。

資料與方法

一、研究對象

選取我院自2018年1月至2019年1月間收治的75例IVF不良結(jié)局患者。

納入/排除標(biāo)準(zhǔn)：婚后同居時間≥1年，行IVF失敗者；對研究知情且自愿參與臨床研究者，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)實施；排除合并染色體核型異常、多囊卵巢綜合征、性激素異常和抗心磷脂綜合征等自身免疫系統(tǒng)疾病者。

依據(jù)IVF失敗類型分成3組：實施IVF≥3次均未獲得妊娠者(反復(fù)失敗組，25例)；實施IVF后僅生化妊娠患者(生化妊娠組，25例)；實施IVF后妊娠12周內(nèi)胚胎停止發(fā)育/自然流產(chǎn)者(流產(chǎn)胚停組，25例)。選取同期生育1次的健康未孕女性25例作為對照組。

二、研究方法

1.試劑與儀器：人淋巴細(xì)胞分離液購自天津灝洋生物制品公司；CD3-APC、CD4-PerCP、CD16-FITC、CD25-FITC、CD56-PE流式抗體和CFSE細(xì)胞膜染料均購自美國eBioscience公司；人CD4+CD25+Treg分選試劑盒、T細(xì)胞活化/擴增試劑盒以及人NK細(xì)胞磁珠分選試劑盒購自美國Miltenyi Biotec公司；牛血清白蛋白、胎牛血清(FBS)和RPMI1640均購自美國Gibco公司；無菌EDTA抗凝采血管、96孔培養(yǎng)板均購自美國BD公司；磷酸鹽緩沖液購自美國SAB公司；EasySep Direct Human Totallymphocyte kit 購自美國Stemcell公司。

變溫冰箱購自韓國SAMSUNG公司，BX51型正立式顯微鏡購自日本Olympus公司；分析天平購自瑞士Mettler Toledo公司，低速離心機購自美國Thermos公司，流式細(xì)胞檢測儀購自美國BD公司。

2.樣本采集：負(fù)壓針采集IVF不良結(jié)局患者、對照組受檢者外周靜脈血樣3 ml，注入6 ml無菌EDTA抗凝管中顛倒2～3次。離心機預(yù)冷至20℃，配置染色緩沖液、破膜/固定液等，置于4℃冰箱待用。采用密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)[6]。

3.測定方法：采用免疫磁珠分選法從PBMC中分離NK細(xì)胞、CD4+CD25-Treg細(xì)胞。

NK細(xì)胞分選、擴增培養(yǎng)及活性檢測：依據(jù)人NK細(xì)胞分選試劑盒說明獲得純化的NK細(xì)胞。染色計數(shù)后采用流式細(xì)胞術(shù)測定純度。取4支試管，依據(jù)表1的方式加入流式抗體和NK細(xì)胞懸液，注意不要碰到管壁，渦旋混勻后室溫避光保存20 min。使用三色流式細(xì)胞檢測儀測定外周血NK細(xì)胞亞群(圖1)，用Cell quest軟件分析換算CD3-、CD56+CD16-和CD56+CD16+細(xì)胞比例。

表1 流式抗體和NK細(xì)胞懸液加入方式

A：CD3-細(xì)胞群分布在P2門內(nèi)；B：CD56+CD16+分布于Q2象限，CD56+CD16-分布于Q1象限，Q1、Q2象限之和為CD56+圖1 流式細(xì)胞檢測儀測定外周血NK細(xì)胞亞群

FoxP3 mRNA表達測定：將CD4+CD25-Treg細(xì)胞與TNF-α活化的NK細(xì)胞共培養(yǎng)，采用抗CD3/CD28微珠刺激培養(yǎng)3 d。采用實時定量PCR(qPCR)技術(shù)以Trizol提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進行PCR擴增。(1)引物：目的基因FoxP3引物序列：上游5’-GAGAAGGAGAAGCTGAGTGCCAT-3’，下游5’-AGCAGGAGCCCTTGTCGGAT-3’，擴增片段154 bp[6]。內(nèi)參基因β-actin引物：上游5’-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3’，下游5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’，擴增片段長度為205 bp。(2)反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 40 s、58℃ 40 s、72℃ 40 s，22個循環(huán)；最后72℃ 7 min。(3)擴增產(chǎn)物：qPCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照。(4)熒光定量檢測：使用圖像分析軟件分析各條帶平均灰度值，β-actin為內(nèi)參照，用FoxP3/β-actin的CT比值表示。

NK細(xì)胞對FoxP3表達的調(diào)節(jié)：將免疫磁珠分離純化的CD4+CD25-Treg細(xì)胞以每孔1×105個加入到96孔板中，均饑餓24 h后同步化，按照不同處理進行分組：M0組(空白組)加3%FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)，M1組加含20 ng/ml的TNF-α，M2組加TNF-α活化的NK細(xì)胞，培養(yǎng)3 d，流式檢測FoxP3的表達情況。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、患者一般資料比較

3組IVF不良結(jié)局患者及對照組間年齡、月經(jīng)周期比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；3組IVF不良結(jié)局患者間不育原因構(gòu)成比較亦無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

二、各組受檢者外周血NK細(xì)胞各亞群水平差異

與對照組比較，3組IVF不良結(jié)局患者CD56+CD16-NK細(xì)胞水平略下降，但4組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。相較于對照組，3組IVF不良結(jié)局患者CD56+NK細(xì)胞、CD56+CD16+NK細(xì)胞水平均顯著升高(P<0.05)；3組IVF不良結(jié)局患者中流產(chǎn)胚停組CD56+NK細(xì)胞水平顯著高于其他兩組(P<0.05)(表3)。

表2 各組患者一般資料比較[(±s)，n(%)]

表3 4組受檢者NK亞群活性百分比(%)比較 (±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與其他各組比較，#P<0.05

三、各組受檢者中CD4+CD25-Treg細(xì)胞中FoxP3 mRNA的表達情況

qPCR檢測結(jié)果顯示，3組IVF不良結(jié)局患者CD4+CD25-Treg細(xì)胞的FoxP3 mRNA表達量存在明顯差異，流產(chǎn)胚停組顯著高于其他兩組(P<0.05)。反復(fù)失敗組和生化妊娠組Treg細(xì)胞中FoxP3 mRNA表達量最低，流產(chǎn)胚停組次之，與健康對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

與對照組比較，*P<0.05；與流產(chǎn)胚停組比較，#P<0.05圖2 qPCR檢測4組間Treg細(xì)胞中FoxP3 mRNA表達情況

四、TNF-α誘導(dǎo)NK細(xì)胞影響CD4+CD25-Treg細(xì)胞中FoxP3表達

取流產(chǎn)胚停組CD4+CD25-Treg細(xì)胞，添加TNF-α培養(yǎng)3 d后(M1組)，F(xiàn)oxP3表達略降低，但與M0組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而CD4+CD25-Treg細(xì)胞與TNF-α活化的NK細(xì)胞共培養(yǎng)3 d后(M2組)，F(xiàn)oxP3表達顯著下降，顯著低于M0組(P<0.05)(圖3)。分析NK細(xì)胞與CD4+CD25-Treg細(xì)胞中FoxP3表達的關(guān)系，顯示兩種細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.51(P<0.05)。

M0：空白組；M1：TNF-α組；M2：TNF-α活化NK細(xì)胞組圖3 TNF-α誘導(dǎo)的NK細(xì)胞對FoxP3表達的影響

討 論

NK細(xì)胞是一群具有獨特殺傷、免疫調(diào)節(jié)功能的大顆粒淋巴細(xì)胞，健康人的外周血中含量僅為淋巴細(xì)胞的5%～10%間。在以往的研究中，人們發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞所介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答在宿主抵抗病原菌感染、惡性腫瘤中發(fā)揮了巨大的作用[7]。近年來，人們發(fā)現(xiàn)外周血NK細(xì)胞數(shù)目增加或毒性表型活性升高，Treg細(xì)胞數(shù)目下降或功能下調(diào)與原發(fā)性不孕、習(xí)慣性流產(chǎn)等密切相關(guān)[8-9]，該兩種細(xì)胞數(shù)目和功能對IVF結(jié)局的預(yù)測價值已得到證實，而作為Treg特征性標(biāo)記物的FoxP3的表達也直接關(guān)系IVF的結(jié)局。本研究分析IVF不良結(jié)局是否與NK細(xì)胞調(diào)節(jié)FoxP3的表達有關(guān)，為改善IVF結(jié)局提供一定參考。

研究中將IVF不良結(jié)局患者依據(jù)失敗類型分成3組，并且與已育健康女性進行對比分析，結(jié)果顯示病例組患者NK細(xì)胞中CD56+、CD56+CD16+活性均顯著高于健康對照組，但3組間CD56+CD16+數(shù)目無明顯差異，而流產(chǎn)胚停組CD56+活性顯著高于其他兩組，可能與檢測操作不當(dāng)形成誤差有關(guān)，亦或者存在某種內(nèi)在聯(lián)系需要進一步驗證；與此同時，4組受檢者細(xì)胞分泌型CD56+CD16-NK細(xì)胞數(shù)目無顯著差異，與路岳超[10]的研究結(jié)果大致吻合，提示IVF不良結(jié)局僅與CD56+、CD56+CD16+NK細(xì)胞數(shù)目增多有關(guān)。NK細(xì)胞中CD56+CD16+細(xì)胞亞群約占NK細(xì)胞亞群的90%以上，其可通過非特異性溶細(xì)胞、抗體Fc段結(jié)合介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(Antibody dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC)，起到殺滅細(xì)胞的作用，因此也被稱之為NK細(xì)胞毒性表型；而起免疫調(diào)節(jié)作用的CD56+CD16-NK細(xì)胞占比約為10%[11-12]。外周血NK毒性表型上調(diào)導(dǎo)致IVF不良結(jié)局的機制可能有以下幾點：首先，NK毒性表型細(xì)胞上調(diào)會影響子宮內(nèi)NK細(xì)胞活性變化，而子宮內(nèi)NK細(xì)胞均由外周血分化而來，子宮內(nèi)NK細(xì)胞增殖會在母胎界面分泌硫酸軟骨素蛋白聚糖、穿孔素等分子繼而發(fā)揮非特異性溶胚胎細(xì)胞作用，導(dǎo)致胚胎細(xì)胞損傷引發(fā)流產(chǎn)[13]；其次，外周血NK毒性表型細(xì)胞數(shù)目增加會促使NK細(xì)胞毒性增強，繼而影響循環(huán)系統(tǒng)的免疫耐受，導(dǎo)致著床失敗。

qPCR檢測結(jié)果顯示不同類型IVF不良結(jié)局患者中FoxP3 mRNA表達存在明顯差異，推測FoxP3參與到了IVF的整個活動中，且對IVF可能起到保護作用。本研究的不足是未開展免疫組化實驗進一步證實FoxP3在血液細(xì)胞中的表達情況，而相關(guān)研究顯示，癌癥細(xì)胞中內(nèi)源性FoxP3多表達于細(xì)胞核中，激光共聚焦結(jié)果顯示多表達于細(xì)胞漿中，主要因為腫瘤組織、細(xì)胞微環(huán)境差異所致，推測在IVF不良結(jié)局中FoxP3表達的不同也對其微環(huán)境起到調(diào)節(jié)作用[14]。

以往的研究和本實驗結(jié)果，均提示外周血NK細(xì)胞毒性表型、Treg細(xì)胞功能表型都參與了IVF不良結(jié)局的過程。有資料顯示，CD56+CD16+NK細(xì)胞活性>12%、CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞<2%對IVF不良結(jié)局有預(yù)測價值[15]。NK細(xì)胞可表達免疫激活型、抑制型受體，并通過這些受體行使其生理功能[16-17]。若相應(yīng)配體和激活型受體發(fā)生結(jié)合，NK細(xì)胞活化后會分泌大量的效應(yīng)分子以發(fā)揮其作用。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)TNF-α活化的NK細(xì)胞刺激CD4+CD25-Treg細(xì)胞后，F(xiàn)oxP3表達量顯著低于空白組(M0組)，雖然經(jīng)單純TNF-α刺激后FoxP3表達也有下降，但差異無顯著性，提示活化的CD56+CD16+NK對FoxP3表達有抑制下調(diào)作用，從而導(dǎo)致Treg細(xì)胞數(shù)目和活性下降。

綜上所述，NK細(xì)胞可通過抑制Treg細(xì)胞中FoxP3的表達來產(chǎn)生非特異性溶胚胎細(xì)胞作用，且可通過抗體Fc段結(jié)合產(chǎn)生ADCC效應(yīng)損傷胚胎細(xì)胞，影響正常的妊娠活動，導(dǎo)致反復(fù)受精失敗、生化妊娠以及流產(chǎn)胚胎停育等不良妊娠結(jié)局發(fā)生。