白謹(jǐn)銘 趙子翔 秦嘉晨 劉鑒輝 梁愛(ài)博

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，泰安 271018）

隨著生活質(zhì)量的提高和環(huán)境及衛(wèi)生狀況的改善，人們對(duì)自身的健康狀況的日益關(guān)注，使得我國(guó)國(guó)民壽命整體得到提升［1］。壽命除受到先天基因遺傳影響，也與后天環(huán)境有很大的關(guān)系［2］。

果蠅生命周期短，并且與人類(lèi)高度同源，是一種十分適合進(jìn)行壽命研究的模式動(dòng)物［3］。2000年，Science報(bào)道，果蠅的基因測(cè)序已經(jīng)基本完成［4］，使在各個(gè)領(lǐng)域?qū)壍难芯烤玫綇V泛應(yīng)用并取得重大突破，這意味著果蠅可作為研究人類(lèi)健康有關(guān)問(wèn)題的最佳模式動(dòng)物［3，5-6］。

吸煙是一種潛在的可能加速衰老從而影響壽命的環(huán)境因素，已然成為影響人類(lèi)的非常嚴(yán)重的公共環(huán)境衛(wèi)生問(wèn)題［7］。研究發(fā)現(xiàn)，主動(dòng)吸煙與被動(dòng)吸煙都都會(huì)嚴(yán)重危害人類(lèi)健康［8-9］。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的統(tǒng)計(jì)數(shù)字，每年全世界因吸煙而死亡的人數(shù)達(dá)到600萬(wàn)；煙民中將會(huì)有半數(shù)因吸煙而提早死亡；暴露在煙霧中的被動(dòng)吸煙者每年死亡人數(shù)約為60萬(wàn)。香煙的煙霧成分極其復(fù)雜，由若干復(fù)雜的有機(jī)物以及很多種氣體和微粒組成［10］，包括很多能引起組織炎癥、致癌及其他危及身體健康的毒性成分［11］，會(huì)對(duì)人類(lèi)健康造成極大的損害，并影響人類(lèi)壽命［10］。

影響壽命與衰老的基因有許多類(lèi)：通過(guò)調(diào)節(jié)代謝而影響壽命的基因有SOD1、SOD2、CAT、GSHPx（在果蠅中同源物為PHGPx），SOD、CAT和PHGPx能夠發(fā)生協(xié)同作用，作為O2-清除劑，使O2-轉(zhuǎn)化為O2，解除氧化脅迫對(duì)機(jī)體的損傷［12］。參與機(jī)體泛素化調(diào)節(jié)與蛋白酶活性調(diào)節(jié)從而影響壽命的有Usp7、Rpn11等，機(jī)體在經(jīng)過(guò)應(yīng)激反應(yīng)后產(chǎn)生大量變性蛋白，usp7、Rpn11在變性蛋白去泛素化重新回收利用的過(guò)程中起到重要作用，并且可以抑制腫瘤產(chǎn)生［13-14］。之前報(bào)道過(guò)MTH及Sirt基因家族與果蠅的壽命也有著密切的關(guān)系，MTH突變體會(huì)比其父本延長(zhǎng)壽命35%［15-17］，Sirt家族的基因表達(dá)降低會(huì)降低正常的壽命［18-19］。

雖然吸煙有害健康，但是煙草是否或怎樣影響生物體的壽命與衰老依然沒(méi)有明確的定論，因此借助果蠅模型探究煙草對(duì)壽命與衰老的影響具有極大的現(xiàn)實(shí)意義。我們希望通過(guò)研究煙草對(duì)果蠅壽命影響的機(jī)制，為吸煙的有害性提供切實(shí)明確的實(shí)驗(yàn)證據(jù)與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 W1118系黑腹果蠅，來(lái)自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物發(fā)育實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 香煙 哈德門(mén)香煙（市售軟包裝，煙堿量：1.0 mg）

1.1.3 酵母粉（安琪酵母有限公司）；葡萄糖（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）；玉米粉（吉林中糧生化能源銷(xiāo)售有限公司）；瓊脂（Solarbio Life Sciences）；尼 泊 金 甲 酯（BBL Life Sciences）；0.45 μm 濾 膜（Millipore）；Trizol（Sangon Biotech）；HiScript?QRT Super Mix with gDNA wiper（Vazyme）；ChamQ SYBR?Color qPCR Master Mix（Vazyme）。

1.1.4 儀器 生化培養(yǎng)箱（江南同君儀器有限公司 HPS-280）；體視顯微鏡（奧林巴斯有限公司SZ61-SET）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠 LDZX-50KBS）；熒光定量PCR儀（BIO-RAD CFX96）；超純水機(jī)（Millipore Milli-Q Integral）。

1.2 方法

1.2.1 浸出煙草內(nèi)含物 將哈德門(mén)香煙去除香煙外的包裝紙得到煙絲，用電子天平稱取煙絲1 g、2 g和3 g，用100 mL重蒸水浸泡24 h，使用0.45 μm濾膜過(guò)濾，得煙草提取液，在4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 制備果蠅培養(yǎng)基 將酵母粉80 g/L加水煮沸20 min后，加入葡萄糖110 g/L、玉米粉40 g/L、瓊脂7.5g/L后再次煮沸，冷卻至65℃并加入尼泊金甲酯1.5 g/L。再加入培養(yǎng)基質(zhì)量1/10的純凈水或不同濃度的煙草提取液并混勻，趁熱倒入平底玻璃培養(yǎng)管（Φ=3.0 cm）中，高度約為1 cm。

1.2.3 構(gòu)建受煙草影響的果蠅模型 使用二氧化碳進(jìn)行麻醉，挑選剛孵化未滿12 h的雄性果蠅，培養(yǎng)于空白對(duì)照培養(yǎng)基（CK）與各不同濃度的煙草培養(yǎng)基（1 g/d、2 g/d和3 g/d）中，每種處理下至少150只。于溫度（25±1）℃濕度（70±10）%的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天定時(shí)檢查記錄果蠅存活情況并更換培養(yǎng)基。

1.2.4 提取樣本總RNA 選取特定時(shí)間點(diǎn)的雄性果蠅進(jìn)行稱重，研磨得到果蠅勻漿，利用改良后的Trizol法［20］提取果蠅總RNA，在RNase-free離心管中加入500 μL Trizol，室溫靜置3 min后4℃ 12 000×g離心10 min，取上清液，加200 μL氯仿，震蕩15 s，室溫靜置2-3 min后4℃ 12 000×g離心15 min，取上清液，加等體積異丙醇，混勻，冰浴靜置10 min后 4℃ 12 000×g離心 10 min，用 500 μL 70% 乙醇漂洗后4℃ 12 000×g離心5 min，去上清液，晾干，加入適量DEPC milliQ溶解獲得樣本總RNA。

1.2.5 Real-time PCR檢測(cè)基因表達(dá)變化 取1 mg RNA，依照說(shuō)明書(shū)使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。得到樣本cDNA后，使用熒光定量?jī)x，依照說(shuō)明書(shū)使用熒光定量試劑盒檢測(cè)有關(guān)基因表達(dá)變化，所用引物見(jiàn)表1。以Actin、β-Tubulin基因作為內(nèi)參，經(jīng)均一化處理后分析基因表達(dá)改變情況。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 使用Origin 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)至少來(lái)自3次獨(dú)立重復(fù)，并通過(guò)t檢驗(yàn)、Breslow檢驗(yàn)或單因素方差分析進(jìn)行分析，然后進(jìn)行Least-Significant Difference檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在未顯示精確P值的情況下，統(tǒng)計(jì)顯著性顯示為*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 ；不同小寫(xiě)字母表示P＜0.05。

表1 兩種內(nèi)參基因與9種與衰老相關(guān)基因的Real-time PCR引物

2 結(jié)果

2.1 煙草影響果蠅壽命

動(dòng)物種群的平均壽命和半數(shù)死亡時(shí)間是衡量群體預(yù)期壽命的重要數(shù)據(jù)。因此，我們通過(guò)每天在固定時(shí)間更換果蠅培養(yǎng)基并統(tǒng)計(jì)果蠅的死亡情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同濃度的煙草處理（1 g/d、2 g/d和3 g/d）對(duì)雄性果蠅平均壽命和半數(shù)死亡時(shí)間的影響，如圖1所示。圖中所有處理組的兩個(gè)壽命指標(biāo)均低于對(duì)照組，當(dāng)煙草達(dá)到一定濃度時(shí)，果蠅的壽命顯著降低。煙草對(duì)果蠅的平均日存活率的影響，如圖2所示。結(jié)合圖1可以發(fā)現(xiàn)煙草對(duì)果蠅壽命的不利影響具有劑量效應(yīng)，其隨著煙草濃度的增加而增加，最終導(dǎo)致日均存活率與對(duì)照組相比出現(xiàn)顯著差異。

2.2 煙草影響雄性果蠅的基因表達(dá)

體內(nèi)CAT、SOD2和Rpn11的表達(dá)顯著上調(diào)，Sirt6的表達(dá)顯著下調(diào)；14 d后，果蠅體內(nèi)PHGPx、SOD2和MTH的表達(dá)顯著上調(diào)，Sirt6的表達(dá)超顯著下調(diào)。21 d后，果蠅體內(nèi)CAT的表達(dá)極顯著上調(diào)，SOD1、SOD2、Sirt2、Usp7和Rpn11的表達(dá)超顯著上調(diào)，PHGPx和MTH的表達(dá)顯著上調(diào)，Sirt6的表達(dá)超顯著下調(diào)。隨著影響時(shí)間的延長(zhǎng)，果蠅中越來(lái)越多的基因受到影響，受影響的情況也更加嚴(yán)重。

圖1 煙草處理對(duì)雄性果蠅壽命的影響

圖2 煙草處理下雄性果蠅壽命曲線

為了揭示果蠅壽命縮短的原因，我們分別在第7天，第14天和第21天檢測(cè)了可能與衰老或壽命相關(guān)的幾個(gè)基因的表達(dá)情況。在煙草的影響下，果蠅中的一些基因表達(dá)水平發(fā)生了顯著的變化。通過(guò)Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)了與果蠅衰老和壽命相關(guān)的9個(gè)基因。結(jié)果如圖3所示。煙草處理7 d后，果蠅

3 討論

隨著人們對(duì)于延長(zhǎng)壽命、減緩衰老等問(wèn)題越來(lái)越關(guān)注，此類(lèi)研究已成為一大熱點(diǎn)。近年來(lái)人們通過(guò)研究存活率、抗氧化酶活性以及與衰老相關(guān)基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多的物質(zhì)具有抗氧化、延緩衰老的作用［21-22］，這為人類(lèi)健康，延長(zhǎng)壽命作出了巨大貢獻(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)在通過(guò)研究存活率以及衰老相關(guān)基因表達(dá)情況中發(fā)現(xiàn)，煙草影響將會(huì)導(dǎo)致果蠅壽命的縮短。

煙草影響到億萬(wàn)煙民乃至國(guó)計(jì)民生，其帶來(lái)的健康危害也不容小覷。由于果蠅的衰老基因和代謝途徑與人類(lèi)非常相近，本研究以W1118系黑腹果蠅為材料，通過(guò)水浸泡煙草提取煙草內(nèi)物質(zhì)處理果蠅，測(cè)定了果蠅的壽命和與衰老有關(guān)的基因表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)吸煙會(huì)縮短果蠅的壽命，對(duì)果蠅生存產(chǎn)生不利影響，甚至引起果蠅體內(nèi)某些基因表達(dá)的變化。在煙草的影響下，幾種抗氧化酶的表達(dá)水平增加，表明在煙草刺激下果蠅遭受了某種氧化脅迫，其很有可能導(dǎo)致果蠅的衰老加速。有研究表明，吸煙會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞遭受氧化脅迫［23］，產(chǎn)生過(guò)多的ROS而導(dǎo)致活性氧消除系統(tǒng)有關(guān)酶類(lèi)和抗氧化物質(zhì)的量顯著上升，這與本研究發(fā)現(xiàn)的煙草導(dǎo)致抗氧化酶基因表達(dá)量升高具有一致性。Sirt6的表達(dá)水平降低也可能說(shuō)明煙草處理對(duì)果蠅細(xì)胞造成不利影響和氧化脅迫，之前研究發(fā)現(xiàn)Sirt家族蛋白質(zhì)是一種在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和壽命中發(fā)揮出關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)，過(guò)表達(dá)Sirt家族基因可以顯著增長(zhǎng)機(jī)體的壽命［19］，煙草影響導(dǎo)致Sirt6表達(dá)降低進(jìn)而影響了果蠅的壽命。Rpn11被報(bào)道編碼一種促進(jìn)26S蛋白酶體活性的蛋白質(zhì)［13］，其增加暗示煙草引起了氧化脅迫，使得細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)受到活性氧影響而未折疊或錯(cuò)誤折疊，最終激活泛素途徑降解［24］。MTH的表達(dá)升高也暗示了一種負(fù)面影響，因該基因作用機(jī)制仍不明確，只發(fā)現(xiàn)敲除該基因會(huì)使雄性果蠅壽命顯著升高，與壽命存在負(fù)相關(guān)關(guān)系［17］。我們認(rèn)為煙草影響主要導(dǎo)致果蠅遭受氧化脅迫進(jìn)而引起早衰，近年來(lái)的研究還證實(shí)了煙草能導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生，影響卵巢正常功能等諸多的疾?。?5-26］，這些疾病可能與氧化損傷一起影響到機(jī)體的健康與壽命。

對(duì)于煙草的萃取人們通常采用水或80%的甲醇水溶液提取，相比有機(jī)溶劑，用水提取成本低、污染小且對(duì)果蠅不會(huì)產(chǎn)生其他影響，在煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 251-2008 中也采用水萃取樣品［27］。在之前相關(guān)的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)用水浸泡煙草與過(guò)濾燃燒后的煙氣兩種方式提取煙草內(nèi)物質(zhì)對(duì)果蠅的影響十分相似，因此我們利用果蠅的開(kāi)管循環(huán)系統(tǒng)，巧妙地以消化道為途徑通過(guò)飼喂含煙草成分的培養(yǎng)基來(lái)處理果蠅，構(gòu)建受煙草影響的果蠅模型。在之前我們也發(fā)現(xiàn)，通過(guò)四層紗布簡(jiǎn)單過(guò)濾的煙草提取液制成的培養(yǎng)基，可以在很低的濃度引起雌性果蠅壽命出現(xiàn)顯著降低本研究中使用0.45 μm濾膜對(duì)煙草提取液進(jìn)行過(guò)濾發(fā)現(xiàn)，對(duì)果蠅壽命產(chǎn)生影響所需的濃度閾值提高了很多，這也與近期的研究結(jié)論一致［28］。因此，香煙濾嘴的過(guò)濾質(zhì)量對(duì)吸煙人群健康的影響也是不容忽視的。

從宏觀的群體平均壽命與微觀的基因表達(dá)調(diào)控的角度，我們均發(fā)現(xiàn)煙草會(huì)對(duì)果蠅的健康產(chǎn)生不利影響，煙草也很可能對(duì)人的生命產(chǎn)生不利影響，其通過(guò)使身體受到氧化損傷而加速衰老。從社會(huì)學(xué)的角度來(lái)看，本研究可以為吸煙引起早衰提供理論依據(jù)，能使人們更深入地了解煙草的危害。未來(lái)，我們也希望從煙草對(duì)蛋白質(zhì)水平的影響和煙草引起早衰的分子機(jī)制進(jìn)行更深入研究。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)重蒸水浸泡香煙煙絲提取煙草內(nèi)物質(zhì)，雄性果蠅經(jīng)煙草影響后壽命出現(xiàn)了顯著縮短，且該影響具有劑量效應(yīng)。果蠅體內(nèi)多種抗氧化酶轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)上調(diào)，泛素化調(diào)節(jié)酶與乙?；皋D(zhuǎn)錄水平也出現(xiàn)改變，暗示氧化脅迫導(dǎo)致果蠅機(jī)體出現(xiàn)早衰。