張曉暉 王毅 李慧芳 高佳麗

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院藥劑部，呼和浩特 010059）

乳酸桿菌是一類對人體有益的微生物，通過定植在腸道上皮細胞，保護腸道免受病原微生物的侵害，常用于預防和治療感染性腹瀉，此外乳桿菌還有調節(jié)機體免疫功能、抗炎、抗氧化等功效［1］。利用益生菌代替抗生素治療急慢性腹瀉、便秘，保護腸道微生態(tài)平衡是治療腸炎性疾病的新途徑。臨床常見的益生菌制劑如“金雙歧”、“貝飛達”、“思連康”等已取得了良好的治療效果［2］。臨床應用最為廣泛的兩大類益生菌包括雙歧桿菌和乳桿菌［3］。乳桿菌通過黏附在腸道內(nèi)壁，并定植于腸道上皮細胞，降低腸道內(nèi)pH，形成不利于病原微生物滋生的微環(huán)境，同時促進腸道黏膜的恢復，阻止病原微生物與腸上皮細胞的接觸，從而抵御致病菌的侵襲［4-5］。研究表明，S-層蛋白是乳桿菌發(fā)揮益生功能的重要因子，S-層蛋白是細菌細胞壁的一種蛋白，分子量為40-200 kD，占細胞總蛋白的10%-15%。乳桿菌的S-層蛋白能夠黏附于腸道上皮細胞，覆蓋了病原菌與腸道上皮細胞結合的受體位點，從而抑制病原菌的黏附［6］。

Ren等［7］的研究表明，唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius）可抑制金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）對Caco-2細胞的黏附，當去除菌株的S-層蛋白后，抑制率由58%下降到4%；嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）的S層蛋白能夠降解大腸桿菌表面的肽聚糖，進而抑制其對HT-29細胞的侵襲［8］。臨床上使用益生菌制劑治療細菌性腸炎已取得了良好的療效，然而常規(guī)劑量的乳酸菌即使能定植于腸道其增值速度也很慢，難以覆蓋整個腸道，大劑量的使用益生菌可能增加其移位的風險，引起不必要的炎癥［9］，同時抗生素類藥物也能影響益生菌制劑的療效［10］，因此開發(fā)能夠應用于臨床的安全、穩(wěn)定且不受抗生素影響的S-層蛋白制劑具有重要的意義。本研究提取獲得嗜酸乳桿菌S-層蛋白，比較其對幾種致病菌感染Caco-2的抑制效果，為后續(xù)開發(fā)該類產(chǎn)品提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、致病性大腸桿菌（Enteropathogenic escherichia coli，EPEC）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SAU）由本實驗室保存。MRS培養(yǎng)基（北京陸橋技術股份有限公司）、鹽酸左氧氟沙星（Sigma）、LiCl（Sigma）、DMEM/F12培養(yǎng)基（Hyclone）、胎牛血清（杭州四季青有限公司），其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌種的發(fā)酵培養(yǎng)和S-層蛋白的提取和純化 嗜酸乳桿菌的培養(yǎng)采用三級發(fā)酵培養(yǎng)法，取凍干菌種1支，接種于MRS培養(yǎng)基中，38℃厭氧培養(yǎng)16 h，按5%的接種量傳代活化，連續(xù)傳兩代得到三級發(fā)酵液，梯度稀釋，平板計數(shù)法測定發(fā)酵液活菌數(shù)。

三級發(fā)酵液4℃、8 000 r/min離心收集菌體，用PBS洗兩次，加入5 mol/L的LiCl，37℃、200 r/min搖床孵育1 h，4℃、8 000 r/min離心收集上清液，放入20 kD的透析袋中4℃透析24 h，期間換液3次，聚乙二醇濃縮，得到S-層蛋白粗提物濃縮液。使用Sephadex G-75凝膠柱進行純化，用pH7.0、0.025mol/L的Tris-HCl作為流動相平衡凝膠柱，上樣，流動相洗脫，流速0.5 mL/min，每5 min換管收集洗脫液，酶標儀280 nm處檢測吸光度，收集洗脫峰，濃縮得到S-層蛋白溶液。

取S-層蛋白粗提物和S-層蛋白溶液進行SDSPAGE凝膠電泳，考馬斯亮藍染色，計算蛋白分子量。BCA法測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書操作進行。

1.2.2 Caco-2細胞培養(yǎng) Caco-2細胞胰酶消化后接種于12孔板中，加入含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，放置二氧化碳培養(yǎng)箱5% CO2、37℃靜置培養(yǎng)。

1.2.3 不同濃度的S-層蛋白對致病菌的抑制作用 選取致病性較強的大腸桿菌EPEC和金黃色葡萄球菌SAU為研究對象，考察不同濃度的S-層蛋白對兩種菌的抑制作用。

Caco-2細胞用PBS清洗3次，加入細胞培養(yǎng)液，加入終濃度為1×108CFU/mL的EPEC或SAU，放置二氧化碳培養(yǎng)箱37℃靜置培養(yǎng)2 h，PBS清洗3次，加入細胞培養(yǎng)液，加入不同濃度（100、200、300 μg/mL）的S-層蛋白，以PBS為對照，放置二氧化碳培養(yǎng)箱37℃靜置培養(yǎng)2 h，PBS清洗3次。加入終濃度為0.2%的Triton×100，反復吹打裂解細胞，保留菌體，梯度稀釋與大腸桿菌顯色培養(yǎng)基（鑒定EPEC）或金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基（鑒定SAU）混勻，培養(yǎng)24 h平板計數(shù)，計算EPEC和SAU活菌數(shù)。

1.2.4 不同時間條件下S-層蛋白對致病菌的抑制作用 同法考察EPEC或SAU侵襲Caco-2細胞0、1、2、4、6、8 h后，S-層蛋白干預2 h對EPEC或SAU的

抑制作用。

1.2.5 嗜酸乳桿菌及S-層蛋白聯(lián)合抗生素對致病菌的抑制作用 同法考察在EPEC或SAU侵襲Caco-2細胞2 h后，1×108CFU/mL的嗜酸乳桿菌或300 μg/mL的S-層蛋白聯(lián)合抗生素（0.5%左氧氟沙星）干預2 h對EPEC或SAU的抑制作用。實驗分組：（1）對照組；（2）嗜酸乳桿菌組；（3）S-層蛋白組；（4）抗生素組；（5）嗜酸乳桿菌+抗生素組；（6）S-層蛋白+抗生素組。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 每組實驗設4個重復，實驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0處理，數(shù)據(jù)采用平均值±標準誤差表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05和P＜0.01表示差異顯著和極顯著。

2 結果

2.1 嗜酸乳桿菌的培養(yǎng)及S-層蛋白的SDS-PAGE

對嗜酸乳桿菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，取三級發(fā)酵液顯微鏡下觀察形態(tài)，結果（圖1-A）顯示，菌體成短桿狀，生長良好，可進行下一步實驗。使用LiCl得到S-層蛋白粗提物，用Sephadex G-75凝膠柱純化，并進行SDS-PAGE，結果（圖1-B）顯示，在45 kD左右有清晰的條帶，與文獻中所描述的S-層蛋白分子量大小一致，且純化后的S-層蛋白條帶單一，可進行后續(xù)實驗。

2.2 不同濃度的S-層蛋白和致病菌作用不同時間條件下的抑菌實驗結果

如圖2-A所示，培養(yǎng)好的Caco-2細胞分別經(jīng)EPEC或SAU處理2 h后，再用不同濃度（100、200、300 μg/mL）的S-層蛋白干預2 h，平板計數(shù)EPEC或SAU的活菌數(shù)。結果顯示，S-層蛋白可明顯抑制EPEC或SAU對細胞的黏附，且程濃度依賴性，其中300 μg/mL的S-層蛋白抑制效果最好，對EPEC或SAU的抑制率分別達到42.2%、31.7%，抑制率%=（對照組活菌數(shù)-干預組活菌數(shù)）/對照組活菌數(shù)×100%。

如圖2-B所示，選取抑菌效果最好的300 μg/mL濃度的S-層蛋白，考察致病菌作用不同時間（0、2、4、8、12 h）后，S-層蛋白對EPEC或SAU的抑制作用。結果顯示，S-層蛋白可明顯抑制EPEC或SAU對細胞的黏附，且在致病菌侵襲短時間內(nèi)干預效果明顯，其中0 h，即EPEC或SAU與S-層蛋白同時加入對細菌的抑制作用最好，對EPEC或SAU的抑制率分別達到59.3%和48.4%。。

圖1 嗜酸乳桿菌的培養(yǎng)及S-層蛋白的SDS-PAGE

2.3 嗜酸乳桿菌及S-層蛋白聯(lián)合抗生素對致病菌的抑制作用結果

為了考察S-層蛋白對比嗜酸乳桿菌的抗菌效果，在EPEC（圖3-A）或SAU（圖3-B）作用Caco-2細胞2 h后，用嗜酸乳桿菌或S-層蛋白聯(lián)合抗生素（0.5%左氧氟沙星）作用Caco-2細胞。結果顯示，較對照組而言，嗜酸乳桿菌組、S-層蛋白組和抗生素組均可明顯抑制EPEC或SAU對Caco-2細胞的侵襲，其中抗生素組的抑制效果最為明顯。當聯(lián)合用藥后，嗜酸乳桿菌+抗生素組并沒有顯示出比抗生素組更強的抑菌效果，可能由于抗生素抑制了嗜酸乳桿菌的作用。S-層蛋白+抗生素組顯示出比抗生素組有更強的抑菌效果，對EPEC和SAU抑菌率分別達到81.7%和78.3%，說明S-層蛋白可與抗生素聯(lián)用，且效果優(yōu)于單獨使用抗生素。

圖2 不同濃度的S-層蛋白和致病菌作用不同時間條件下的抑菌實驗結果

3 討論

近年來，利用乳桿菌對抗病原微生物的入侵已成為研究的熱點，乳桿菌的黏附定植是其發(fā)揮作用的前提，定植后的乳桿菌可以和腸道上皮細胞作用，形成保護層，阻止病原微生物與腸道的接觸黏附，從而減輕腸炎類疾病的發(fā)生。研究表明，S-層蛋白是乳桿菌黏附腸道細胞的關鍵蛋白［11］。Johnson等［12］的研究顯示，從瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）中提取的S-層蛋白可以抑制出血性大腸桿菌O157：H7對上皮細胞的黏附；同樣Golowczyc等［13］的研究表明，克菲爾乳桿菌（Lactobacillus kefir）通過其表面的S-層蛋白保護了腸道免受腸炎沙門氏菌的損傷。本研究考察了嗜酸乳桿菌S-層蛋白在不同濃度和時間條件下對致病性較強的EPEC或SAU侵襲Caco-2細胞的干預作用，結果表明S-層蛋白可明顯抑制EPEC或SAU的侵襲。在比較了嗜酸乳桿菌與S-層蛋白聯(lián)合抗生素對致病菌的作用后發(fā)現(xiàn)，S-層蛋白與抗生素聯(lián)用表現(xiàn)出協(xié)同抗菌作用，而嗜酸乳桿菌與抗生素聯(lián)用則表現(xiàn)出拮抗作用。目前上市的益生菌活菌制劑均采用干粉狀態(tài)保存，進入人體后必須定植于腸道，并利用腸道內(nèi)的營養(yǎng)成分生長才能發(fā)揮益生作用，而抗生素會抑制益生菌的生長，從而影響其功能。S-層蛋白則避免了這種弊端，這也是本研究首次證明了嗜酸乳桿菌的S-層蛋白可以和抗生素聯(lián)用，起到協(xié)同效果。

圖3 嗜酸乳桿菌及S-層蛋白聯(lián)合抗生素對EPEC（A）和SAU（B）的抑制作用結果

S-層蛋白具有基因多樣性，即不同來源的S-層蛋白具有不同的晶格結構和生物學功能，乳桿菌的S-層蛋白是其具有定植和黏附功能的主要蛋白［14］。研究表明，一些種屬的乳桿菌S-層蛋白能夠裂解革蘭氏陽性菌細胞壁，如嗜酸乳桿菌、瑞士乳桿菌和卷曲乳桿菌［15］。干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）S-層蛋白能夠顯著抑制致病菌導致的HT-29細胞產(chǎn)生PGE2和NO。同時，能刺激HT-29細胞產(chǎn)生輕微的NF-?B核移位，也能一定程度上抑制S. sonnei引起的NF-?B核移位［16］。本研究顯示嗜酸乳桿菌S-層蛋白與抗生素能夠協(xié)同作用抑制EPEC或SAU，然而該菌的S-層蛋白是否有抵抗炎癥的作用還有待進一步驗證。S-層蛋白來源于安全性極高的乳酸菌，因此開發(fā)相關產(chǎn)品應用于臨床具有較好的應用前景。

4 結論

本研究證明了嗜酸乳桿菌S-層蛋白可濃度依賴性的抑制致病性大腸桿菌和金黃色葡萄球菌對Caco-2的侵襲，在致病菌感染初期干預最為有效，并且S-層蛋白與抗生素聯(lián)用有協(xié)同抑菌效果，有望開發(fā)成為一種新型的抗菌藥物。