張春晨 胡雙艷 阮海華

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

溶菌酶，又稱胞壁質(zhì)酶，是由亞歷山大·弗萊明發(fā)現(xiàn)并命名的一種多糖水解酶［1］，能夠水解細菌細胞壁肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰-D-葡萄糖胺之間的β-1，4-糖苷鍵，導(dǎo)致細菌死亡［2］?；谌芫傅陌被嵝蛄泻蜕锘瘜W(xué)性質(zhì)，其被分為3種類型：C型（Chicken or Conventional type），G型（Goose type）和 I型（Invertebrate type）［3］。人源溶菌酶（Human lysozyme，HLZ）屬于C型溶菌酶，是一種由130個氨基酸組成的分子量約為14.7 kD的單體蛋白［4-5］。其氨基酸序列中富含堿性氨基酸、帶正電荷、等電點（pI）約為11.0［6］。人源溶菌酶的空間結(jié)構(gòu)如圖1所示，它是由3個α螺旋（H1、H2和H3）與3個β折疊（S1、S2和S3）進一步卷曲折疊構(gòu)成的具有特定構(gòu)象的緊湊結(jié)構(gòu)（圖1-A）［7-8］。其結(jié)構(gòu)中所含有的4對二硫鍵（-S-S-）在穩(wěn)定其空間結(jié)構(gòu)和蛋白復(fù)性中具有重要作用（圖1-B）［9］。

人源溶菌酶廣泛分布于人體器官、細胞和體液中［6，10］。已報道的含有人源溶菌酶的器官有肺、腎、胎盤等；細胞有巨噬細胞、白細胞等；體液有眼淚、唾液、尿液、血清和乳汁等［11］。其作為一種非特異性免疫因子和抗炎因子，人源溶菌酶在人體防御機制中扮演著重要角色［12］。此外，很多研究表明人源溶菌酶還具有抗真菌和抗病毒的作用［13-14］。在活性方面，其抗菌活性是雞蛋清溶菌酶的3倍，是牛溶菌酶的10倍［15］。目前，人源溶菌酶已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品加工（食品防腐劑、保鮮劑、嬰幼兒奶粉配方）、畜牧業(yè)、化妝品及醫(yī)藥等領(lǐng)域［16-19］。

然而，天然人源溶菌酶來源缺乏，不能充分提供產(chǎn)品，限制了人源溶菌酶的廣泛應(yīng)用?；蚬こ碳夹g(shù)的發(fā)展使得人源溶菌酶已經(jīng)在很多微生物系統(tǒng)中成功表達，如真菌、植物和動物等［20-22］。和這些生物反應(yīng)器相比，大腸桿菌表達系統(tǒng)作為蛋白質(zhì)異體表達最常用的宿主系統(tǒng)，具有成本低、蛋白表達量高、繁殖周期短、操作簡便以及產(chǎn)品純凈等優(yōu)點［23-24］。然而，在大腸桿菌中表達的重組人源溶菌酶在細胞內(nèi)常以不溶性的沒有生物活性的包涵體形式累積，從這些包涵體中恢復(fù)其生物活性成為DNA重組技術(shù)廣泛應(yīng)用的一個難題［25］。對于富含二硫鍵的人源溶菌酶而言，如何在體外復(fù)性過程中有效地形成正確配對的二硫鍵是復(fù)性的關(guān)鍵性問題之一［26-27］。

圖1 人源溶菌酶的空間結(jié)構(gòu)圖

本研究旨在將人源溶菌酶編碼基因的密碼子進行優(yōu)化，構(gòu)建能夠在大腸桿菌中高效表達的系統(tǒng)，并進一步通過包涵體體外復(fù)性技術(shù)獲得具有高生物活性的人源溶菌酶。同時探究一步透析、梯度透析和梯度稀釋3種復(fù)性方式以及復(fù)性液中谷胱甘肽氧化還原對（GSSG/GSH）、精氨酸、甘油等復(fù)性物的濃度對重組人源溶菌酶復(fù)性的影響，獲得最佳的復(fù)性方案［28-30］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株 原核表達載體pET21a由本實驗室提供；大腸桿菌Trans10和BL21（DE3）感受態(tài)細胞購買于北京全式金生物有限公司；溶壁微球菌由北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院提供。

1.1.2 酶和試劑 人源溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品購買于北京經(jīng)科宏達生物技術(shù)有限公司；NdeⅠ和XhoⅠ限制性核酸內(nèi)切酶購買于日本TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購買于美國Promega公司；DNA Marker 5000購買于康為世紀(jì)生物科技有限公司；瓊脂糖、尿素、DTT、EDTA、Triton X-100、IPTG、PMSF購買于美國Amresco公司；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒購買于北京天根公司；PageRuler Prestained Protein Marker購買于美國Thermo Scientific公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 Allegra-64R高速低溫離心機（美國Beckman公司）；SpectraMax M5多功能讀板機（美國Molecular Device公司）；AlphaImager Mini凝膠成像系統(tǒng)（美國ProteinSimple公司）；5430R小型臺式高速冷凍離心機（美國Eppendorf公司）；SPX-150生化培養(yǎng)箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠）；HZQ-QX全溫振蕩器（哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；JY98-Ⅲ超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 人源溶菌酶基因的優(yōu)化與合成 利用NCBI網(wǎng)站對人源溶菌酶的氨基酸序列進行BLAST比對，得到其基因序列（基因號：D00413.1）。由于大腸桿菌對密碼子的偏好性會影響到基因的表達水平，因此，根據(jù)大腸桿菌密碼子使用頻率表對人源溶菌酶基因進行優(yōu)化。根據(jù)pET21a質(zhì)粒多克隆位點，選擇在基因序列的5'端引入NdeⅠ酶切位點（5'CA^TATG3'），在3'端引入XhoⅠ酶切位點（5'C^TCGAG3'）。最后，將設(shè)計好的目的基因序列交由南京金斯瑞生物科技有限公司進行合成。

1.2.2 在大腸桿菌中表達重組人源溶菌酶表達載體的構(gòu)建 利用NdeⅠ和XhoⅠ對含有合成人源溶菌酶基因的pUC57-HLZ質(zhì)粒進行雙酶切后，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目標(biāo)DNA片段。將回收后的HLZ基因與pET21a連接后篩選pET21a-HLZ陽性克隆交由上海生工有限公司進行DNA測序驗證。

1.2.3 人源溶菌酶在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達及可溶性檢測 將重組質(zhì)粒pET21a-HLZ轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，挑取單克隆至5 mL 含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，并于37℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物按照1%接種量接入LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至菌液OD600nm在0.6-0.8之間。向培養(yǎng)物中加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑，于37℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h；將培養(yǎng)液于4℃、4 000 r/min條件下離心30 min，棄上清，保留菌體沉淀；將上述收集的菌體利用50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），內(nèi)含 150 mmol/L NaCl、1 mmol/L PMSF的緩沖溶液于冰上進行超聲破碎，超聲3 s、間隔7 s，超聲約20 min至懸液半透明；將上述菌液于12 000 r/min、4℃條件下離心20 min，分離上清和沉淀。取適量誘導(dǎo)前后菌體以及菌體破碎后的上清和沉淀，加入5×SDS上樣緩沖液混勻，煮沸10min后離心1 min，進行SDS-PAGE檢測，觀察蛋白表達情況，以未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌為陰性對照。

1.2.4 人源溶菌酶包涵體復(fù)性條件的研究 首先，利用洗滌液（50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、100 mmol/L NaCl、2 mol/L尿素、1 mmol/L EDTA）對包涵體進行洗滌以除去包涵體中的脂類和部分雜蛋白。然后，將上述溶液于12 000 r/min、4℃條件下離心20 min，保留沉淀，沉淀即為粗制的包涵體。最后，利用變性液（50 mmol/L Tris-HCl pH8.0、20 mmol/L DTT、8mol/L尿素）對洗滌后的包涵體進行溶解，在4℃攪拌變性1-2 h，離心20 min，收集上清，上清即為包涵體溶解液。

1.2.4.1 復(fù)性方式對人源溶菌酶復(fù)性的影響 利用 復(fù) 性 液（50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、50 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA）分別探究一步透析、梯度透析和梯度稀釋3種復(fù)性方式對人源溶菌酶復(fù)性的效果。一步透析法是將適量的包涵體溶解液置于上述復(fù)性液中進行透析，4℃磁力攪拌12-24 h，中途換一次復(fù)性液。然后，將復(fù)性后溶液于12 000 r/min、4℃條件下離心20 min，保留上清。梯度透析法是以2倍的梯度將包涵體溶解液依次置于含有4 mol/L、2 mol/L、1 mol/L、0.5 mol/L和0.25 mol/L，以及不含尿素的復(fù)性液中進行透析，每隔3 h換液，將透析后溶液離心后保留上清。梯度稀釋法是以2倍的梯度（2、4、6、8和16倍）對包涵體溶解液進行逐級稀釋直至尿素濃度達到0.5 mol/L，稀釋過程中要將含有目標(biāo)蛋白的溶液緩慢滴加至復(fù)性液中以減少蛋白聚集，稀釋完畢后將蛋白溶液于不含尿素的復(fù)性液中進行透析。

1.2.4.2 GSSG/GSH濃度比值對人源溶菌酶復(fù)性的影響 當(dāng)復(fù)性液中分別添加濃度比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5的GSSG/GSH時，利用上一步確定好的最佳復(fù)性方式對包涵體進行復(fù)性，然后依據(jù)方法1.2.5進行抗菌活性檢測，進而確定GSSG/GSH最佳濃度比例。

1.2.4.3 精氨酸濃度對人源溶菌酶復(fù)性的影響 同樣地，當(dāng)復(fù)性液中分別添加1、2、3、4和5 mmol/L精氨酸時，利用最佳復(fù)性方式進行復(fù)性，根據(jù)不同條件下的酶比活力值來確定精氨酸的最佳濃度。

1.2.4.4 甘油濃度對人源溶菌酶復(fù)性的影響 當(dāng)復(fù)性液中分別添加2%、4%、6%、8%和10%甘油時，同樣通過最佳復(fù)性方式對包涵體進行復(fù)性，探究甘油的最佳添加量。最后，根據(jù)上述實驗結(jié)果，利用最佳復(fù)性方式以及同時添加最佳濃度的GSSG/GSH、精氨酸和甘油的復(fù)性液對包涵體進行復(fù)性，然后測定人源溶菌酶的最佳酶比活力，與人源溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品的比活力值進行比較。

1.2.5 人源溶菌酶抗菌活性的檢測 利用瓊脂板擴散法來檢測上述復(fù)性后人源溶菌酶的抗菌活性［6］，即根據(jù)樣品能否抑制底物（溶壁微球菌）生長從而產(chǎn)生透明的抑菌圈來初步判斷復(fù)性是否成功。以復(fù)性液和人溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品分別作為空白對照和陽性對照，重復(fù)3次。

利用比濁法來測定人源溶菌酶的比活力值［6］。酶比活力的定義是：在pH 6.2、25℃反應(yīng)條件下，單位質(zhì)量的溶菌酶每分鐘引起細菌懸液OD450nm的變化值為1個酶活力單位（U）［5］。利用磷酸鈉緩沖液（pH 6.2）制備溶壁微球菌懸液使其OD450nm約為0.7；將底物與酶液或緩沖液（空白對照）按照一定比例混合后立即測定OD450nm，每隔10 min測一次。每組設(shè)定3個平行。酶比活力計算公式為：酶比活力（U/mg）= 酶活力（U/mL）/濃度（mg/mL）。

2 結(jié)果

2.1 人源溶菌酶基因的優(yōu)化與合成

為了提高人源溶菌酶在大腸桿菌中的表達效率，根據(jù)大腸桿菌密碼子使用頻率表對人源溶菌酶基因中的密碼子使用頻率進行分析，結(jié)果如圖2所示，縱坐標(biāo)代表密碼子的使用頻率，橫坐標(biāo)為氨基酸對應(yīng)的密碼子，綠色和紅色分別代表使用頻率高于和低于10%的密碼子。從圖中可知，該序列中使用頻率低于10%的密碼子數(shù)量占總數(shù)的12%（17/131），在理想范圍內(nèi)（0-30%）。經(jīng)過優(yōu)化后的人源溶菌酶基因序列如下圖3所示。

2.2 在大腸桿菌中表達重組人源溶菌酶表達載體的構(gòu)建

將含有合成人源溶菌酶基因片段的pUC57-HLZ質(zhì)粒進行亞克隆連接至pET21a構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET21a-HLZ，挑取陽性克隆進行測序驗證，測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒中的目的基因序列正確，表明重組表達質(zhì)粒pET21a-HLZ構(gòu)建成功。

2.3 人源溶菌酶的誘導(dǎo)表達及可溶性檢測

如圖4-A所示，在37℃誘導(dǎo)溫度下，利用0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)重組菌表達后發(fā)現(xiàn)與未誘導(dǎo)的大腸桿菌相比，IPTG成功誘導(dǎo)了一條分子量介于10-17 kD間的蛋白質(zhì)的表達，該蛋白的分子量與預(yù)期的人源溶菌酶的分子量（14.7 kD）相近。將大腸桿菌進行超聲破碎后離心，分別取上清和沉淀進行SDSPAGE電泳，發(fā)現(xiàn)表達人源溶菌酶的大腸桿菌上清中幾乎沒有重組蛋白的存在，絕大部分人源溶菌酶在沉淀中以包涵體的形式存在。

如圖4-B所示，利用含有2 mol/L尿素的洗滌液對包涵體進行洗滌3次，除去雜蛋白后再使用含有8 mol/L尿素的變性液對洗滌后的包涵體進行變性溶解，得到了較純的分子量為14.7 kD的溶菌酶。

2.4 人源溶菌酶包涵體復(fù)性條件的研究

2.4.1 復(fù)性方式對人源溶菌酶復(fù)性的影響 包涵體經(jīng)一步透析、梯度透析及梯度稀釋3種復(fù)性方式進行復(fù)性后進行抑菌活性檢測，結(jié)果如圖5-A所示，空白對照未產(chǎn)生抑菌圈，經(jīng)梯度透析復(fù)性后人源溶菌酶產(chǎn)生的抑菌圈最大，其次是經(jīng)梯度稀釋和一步透析復(fù)性后樣品，但遠小于人源溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生的抑菌圈。比濁法實驗結(jié)果如圖5-B所示，以上3種復(fù)性方式以及標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的酶比活力值分別為147 U/mg、335 U/mg、176 U/mg 和 1 732 U/mg，表明最佳復(fù)性方式是梯度透析復(fù)性法。

2.4.2 GSSG/GSH濃度比值對人源溶菌酶復(fù)性的影響 如圖6-A所示，空白對照無抑菌活性，當(dāng)復(fù)性液中分別添加濃度比為1∶1、1∶2、1∶3和1∶4的GSSG/GSH時，經(jīng)梯度透析復(fù)性后人源溶菌酶產(chǎn)生的抑菌圈均大于未加及添加1∶5的GSSG/GSH時復(fù)性后人源溶菌酶產(chǎn)生的抑菌圈，其中1∶2的GSSG/GSH對應(yīng)的抑菌圈最大，但比標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生的抑菌圈小。

圖2 人源溶菌酶基因的密碼子分析結(jié)果

圖3 人源溶菌酶的DNA序列

圖4 人源溶菌酶在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達及純化的SDSPAGE電泳圖

從圖6-B可知，0∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5的GSSG/GSH以及標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的酶比活力分別為 335 U/mg、642 U/mg、928 U/mg、766 U/mg、574 U/mg、517 U/mg和1 732 U/mg，表明GSSG/GSH的最佳濃度比例是1∶2。

2.4.3 精氨酸濃度對人源溶菌酶復(fù)性的影響 如圖7-A所示，空白對照未產(chǎn)生抑菌圈，當(dāng)復(fù)性液中未加以及分別添加1、2、3、4和5 mmol/L精氨酸時，4 mmol/L精氨酸條件下復(fù)性的人源溶菌酶產(chǎn)生的抑菌圈比其他濃度精氨酸條件下復(fù)性的人源溶菌酶的抑菌圈大，但小于標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生的抑菌圈。

從圖7-B可知，當(dāng)復(fù)性液中未加以及分別添加1、2、3、4和5 mmol/L精氨酸時，測得酶比活力值分別為 335 U/mg、485 U/mg、519 U/mg、636 U/mg、786 U/mg和703 U/mg，均低于標(biāo)準(zhǔn)品1 732 U/mg的比活力值，表明精氨酸的最佳濃度是4 mmol/L。

2.4.4 甘油濃度對人源溶菌酶復(fù)性的影響 如圖8-A所示，空白對照未產(chǎn)生抑菌圈，當(dāng)復(fù)性液中添加6%甘油時，復(fù)性后人源溶菌酶產(chǎn)生的抑菌圈明顯比未加以及添加2%、4%、8%和10%甘油條件下的抑菌圈大，但比標(biāo)準(zhǔn)品的抑菌圈小。

從圖8-B中可以看出，當(dāng)復(fù)性溶液中不加以及分別添加2%、4%、6%、8%和10%甘油時，測得復(fù)性后人源溶菌酶的比活力分別為335 U/mg、422U/mg、504 U/mg、612 U/mg、571 U/mg 和 562 U/mg，均低于標(biāo)準(zhǔn)品1 732 U/mg的比活力值。因此，甘油的最佳添加量為6%。

圖5 復(fù)性方式對人源溶菌酶復(fù)性的影響

圖6 GSSG/GSH濃度比值對人源溶菌酶復(fù)性的影響

圖7 精氨酸濃度對人源溶菌酶復(fù)性的影響

圖8 甘油濃度對人源溶菌酶復(fù)性的影響

如圖9-A所示，空白組無抑菌活性，當(dāng)復(fù)性液中同時添加濃度比為1∶2的GSSG/GSH、4 mmol/L精氨酸和6%甘油時，復(fù)性后人源溶菌酶產(chǎn)生的抑菌圈明顯比未加復(fù)性物時人源溶菌酶產(chǎn)生的抑菌圈大，而且與標(biāo)準(zhǔn)品的抑菌圈大小接近。

從圖9-B可知，3種復(fù)性物均加時的最佳比活力值為1 170 U/mg，遠高于3種復(fù)性物均不加時人源溶菌酶335 U/mg的比活力值，但低于人溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品1 732 U/mg的比活力值。

圖9 最佳濃度的復(fù)性物對人源溶菌酶復(fù)性的影響

3 討論

溶菌酶具有安全、無毒、無副作用等優(yōu)良特性，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品添加劑、防腐劑、嬰幼兒奶粉配方以及保健品中，市場上對溶菌酶制劑的需求量與日俱增［31］。國內(nèi)溶菌酶的主要來源是從雞蛋的蛋清和蛋殼中提取，國外則以動物和霉菌為原料進行生產(chǎn)［32］。然而雞源溶菌酶活性僅僅是人源溶菌酶活性的三分之一，同時有部分人群對溶菌酶制劑過敏，有研究表明過敏源來自于蛋清［33］。所以人源溶菌酶可能是其未來最好的替代品。

1986年，Jigami等［34］在人源溶菌酶前接上一段雞源溶菌酶信號肽，從啤酒酵母中分泌出了有活性的人源溶菌酶。1987年，Hayakawa［35］利用啤酒酵母成功表達出重組人源溶菌酶，但是因其以包涵體形式存在而不具有活性，而后在大腸桿菌中表達，又存在溶菌酶產(chǎn)量小和活性低的問題。2006年，Maga等［36］在山羊乳腺中成功表達人源溶菌酶成功抑制了引起乳腺炎和牛奶冷腐敗的細菌生長。李寧院士［37］團隊2011年在豬乳腺上得到人源溶菌酶表達，并獲得高產(chǎn)和穩(wěn)定遺傳。人源溶菌酶已經(jīng)在很多生物系統(tǒng)中成功表達，其中，真菌表達系統(tǒng)雖然表達水平高，但是目的蛋白易發(fā)生翻譯后修飾，如糖基化、磷酸化等修飾；植物和動物表達系統(tǒng)存在繁殖周期長、操作復(fù)雜等缺點，而且動物表達系統(tǒng)容易使溶菌酶產(chǎn)品污染致病菌。本研究成功將人源溶菌酶基因在大腸桿菌中表達，但是溶菌酶以包涵體的形式存在。眾所周知，包涵體蛋白利用的局限性在于缺乏有效的復(fù)性方法。本研究通過包涵體體外復(fù)性技術(shù)成功獲得了具有高活性的人源溶菌酶。在復(fù)性過程中，使用溫和的增溶過程保留蛋白質(zhì)的部分二級結(jié)構(gòu)，并尋找合適比例的GSSG/GSH氧化還原劑和甘油溶液，為促進人源溶菌酶正確二硫鍵的形成提供更佳的氧化還原環(huán)境和滲透壓，提高復(fù)性效率，這也是從包涵體中回收生物活性蛋白的關(guān)鍵［38］。

雖然，本研究成功實現(xiàn)人源蛋白質(zhì)在大腸桿菌中表達并成功復(fù)性，但如果用于大批量生產(chǎn)，其復(fù)性率和酶活力還有待進一步提高。而且，IPTG誘導(dǎo)劑的價格昂貴，具有毒性，不適合批量生產(chǎn)，所以下一步可以從以下兩個方面改進。第一，選擇帶有溫控啟動子的表達載體，其成本低，安全無毒；第二，進一步研究蛋白質(zhì)復(fù)性機制，尋找更加溫和的變性劑，減少蛋白質(zhì)在復(fù)性過程中發(fā)生聚集。目前，開發(fā)易操作、新型高效且普適性好的蛋白質(zhì)復(fù)性方法是生物工程下游純化技術(shù)的研究熱點，也是基因工程蛋白質(zhì)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的需要［39］。

4 結(jié)論

優(yōu)化人源溶菌酶編碼基因密碼子在大腸桿菌菌株BL21（DE3）中成功誘導(dǎo)表達，并利用包涵體復(fù)性體系在復(fù)性液中同時添加濃度比為1∶2的GSSG/GSH、4 mmol/L精氨酸和6%甘油時使用梯度透析法成功復(fù)性出人源溶菌酶，其比活力值為1 170 U/mg。