杭鑫茹 耿榮慶 錢林

（1. 南京工業(yè)大學(xué)，南京 210000；2. 鹽城師范學(xué)院，鹽城 224051；3. 江蘇省免疫診斷工程技術(shù)研究中心，蘇州 215028）

過敏性疾病又稱變態(tài)反應(yīng)性疾病，是當(dāng)前世界性的重大衛(wèi)生學(xué)問題。世界衛(wèi)生組織（WHO）將過敏列為21世紀(jì)重點(diǎn)防治的三大疾病之一［1-5］，全球發(fā)病率約為15%-30%，我國(guó)約5%-10%的人患有過敏，且發(fā)病率逐年上升。

牛奶中含有豐富的蛋白質(zhì)組分，為人類提供了重要的營(yíng)養(yǎng)，改善著人類的健康狀況，更是嬰幼兒飲食中添加最早的食物之一。然而，牛奶作為八大主要食物過敏原之一，能引起嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。特別是牛奶中的多種蛋白質(zhì)都能引起食物過敏反應(yīng)，兒童的牛奶過敏發(fā)生率已高達(dá)1.2%-17%［6-8］。β-乳球蛋白、酪蛋白和α-乳白蛋白是牛奶過敏原組分中含量最多、致敏性最強(qiáng)的蛋白組分［9］。牛奶過敏可劃分為IgE介導(dǎo)和非IgE介導(dǎo)，在IgE介導(dǎo)的牛奶過敏性疾病中大約有60%是由β-乳球蛋白引起［10］。β-乳球蛋白也被稱為Bosd5，分子量為18.3 kD，由178個(gè)氨基酸組成，在牛奶中占比約10%，其在乳清中則含量很高，約占乳清總蛋白的50%［11］。

牛奶過敏原檢測(cè)的方法主要基于蛋白水平和核酸水平［12-13］，在蛋白水平上包括電泳法、色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、生物免疫傳感器法、質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)（LC-MS/MS）等檢測(cè)技術(shù)，在核酸水平上通常采用普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等檢測(cè)技術(shù)。雖然這些方法在一定程度上能夠滿足檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性要求，但還沒有一種方法可以滿足多樣化的樣品檢測(cè)要求。隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的快速發(fā)展，自動(dòng)化、高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確度和低成本等特點(diǎn)的檢測(cè)方法是牛奶過敏原檢測(cè)的發(fā)展方向。

納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)是以納米級(jí)磁性微粒做固相載體，使抗原、抗體最大限度結(jié)合，且兼具化學(xué)發(fā)光與酶免疫技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，以化學(xué)發(fā)光劑為底物的酶免疫技術(shù)［14］。其原理是磁微粒上連接鏈霉親和素，抗原進(jìn)行生物素化后通過生物素-親和素特異性結(jié)合形成固相抗原；血清中抗體和固相抗原反應(yīng)，再加入被酶標(biāo)記過的二抗；然后加入酶促化學(xué)發(fā)光底物，在酶作用下底物被催化裂解，形成激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)激發(fā)態(tài)中間體回到基態(tài)時(shí)發(fā)出光子，儀器接受光信號(hào)，測(cè)定光強(qiáng)度，以強(qiáng)度的強(qiáng)弱反應(yīng)待檢樣品中抗原或者抗體的含量。與傳統(tǒng)的免疫印跡及酶聯(lián)免疫法相比，納米磁微粒法具有高靈敏度和特異性以及寬線性范圍的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合全自動(dòng)高靈敏度的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀，在體外診斷領(lǐng)域得到越來越多的關(guān)注和應(yīng)用。

本研究構(gòu)建體外載體表達(dá)系統(tǒng)以制備重組β-乳球蛋白，經(jīng)分離純化后采用生物素標(biāo)記，通過在納米磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫平臺(tái)上檢測(cè)驗(yàn)證，建立穩(wěn)定的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法，旨為研制滿足市場(chǎng)需要的牛奶過敏原檢測(cè)技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

限制性內(nèi)切酶BamH I、XhoI和ScaI購(gòu)買于美國(guó)Thermo公司；生物素標(biāo)記試劑盒購(gòu)于英國(guó)Innova Biosciences公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒和大腸桿菌Rosetta購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司；質(zhì)粒載體pET22b（+）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（LumiRay 1260）購(gòu)于深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 合成目的基因 從NCBI主頁(yè)查詢Bosd5蛋白的編碼區(qū)全長(zhǎng)序列（GenBank登錄號(hào)X14712），密碼子優(yōu)化后在5'端、3'端分別添加BamH I、XhoI酶切位點(diǎn)，委托蘇州金唯智生物科技有限公司合成目的基因序列。

1.2.2 重組表達(dá)載體構(gòu)建與酶切鑒定 原核表達(dá)載體pET-22b（+）分別用限制性內(nèi)切酶BamH I、XhoI雙酶切，將Bosd5基因片段與pET-22b（+）的酶切產(chǎn)物連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-22b（+）-Bosd5。質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒后，采用XhoI和ScaI雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物。

1.2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化 將重組的pET-22b（+）-Bos d5轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞Rosetta，挑取過夜培養(yǎng)單菌落接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，再按1%的比例接種放大培養(yǎng)，在OD600為0.6時(shí)加入終濃度為0.01 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，蛋白以包涵體形式存在。菌體中加入細(xì)菌裂解液和0.1 mmol /L的PMSF，用8mol /L尿素溶解處理包涵體。將裂解的包涵體溶液上樣于預(yù)先平衡好的Ni柱，然后以20 mmol /L 的咪唑緩沖液洗去雜質(zhì)蛋白，最后用500 mmol /L的咪唑緩沖液對(duì)目的蛋白進(jìn)行洗脫。將純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，鑒定重組蛋白的表達(dá)情況。

1.2.4 重組蛋白的化學(xué)發(fā)光檢測(cè) 將重組Bosd5蛋白用Innova生物素標(biāo)記試劑盒標(biāo)記后，采用納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光平臺(tái)以間接法驗(yàn)證重組蛋白功能。校準(zhǔn)曲線采用全點(diǎn)定標(biāo)，人源性IgE蛋白有7個(gè)濃度的 校 準(zhǔn) 品：0 IU/mL（S0）、0.35 IU/mL（S1）、0.7IU/mL（S2）、3.5 IU/mL（S3）、17.5 IU/mL（S4）、50 IU/mL（S5）、100 IU/mL（S6）。第 1 步 ：加 20 μL 樣本至發(fā)光管中，再加50 μL鏈霉親和素共價(jià)偶聯(lián)而成的磁性納米顆粒，然后加入50 μL生物素標(biāo)記的Bosd5，混勻，于37℃孵育15 min，形成固相抗原。第2步：清洗液清洗3次，加入135 μL堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgE抗體，混勻，于37℃孵育15 min形成抗原-抗體-二抗的反應(yīng)模式。第3步：清洗液清洗3次，加150 μL發(fā)光底物液，37℃避光孵育5 min，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)光子數(shù)。納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)光子數(shù)，代入校準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中β-乳球蛋白特異性IgE抗體的含量。

1.2.5 最低檢出限 將S0作為樣本重復(fù)測(cè)定20次，S1重復(fù)測(cè)5次，算出S0重復(fù)測(cè)定濃度的平均值（M）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），得出M+2SD，代入S0、S1的濃度和發(fā)光值平均值擬合得出的方程，計(jì)算得到的濃度值即為最低檢出限（Limit of detection，LOD）。

1.2.6 方法學(xué)比對(duì) 收集110份臨床樣本，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法（CLIA）和免疫熒光法（FEIA）試劑盒同時(shí)檢測(cè)臨床樣本中牛奶β-乳球蛋白sIgE抗體，以0.35IU/mL作為cut-off值［15-16］，對(duì)2種方法學(xué)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行陰陽(yáng)性符合率、總符合率以及線性分析。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件，對(duì)CLIA、FEIA檢測(cè)的牛奶過敏原β-乳球蛋白陰陽(yáng)性測(cè)定值進(jìn)行卡方檢驗(yàn)和Kappa檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平為 0.05。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果

將優(yōu)化后的的Bosd5基因連接到pET-22b（+）表達(dá)載體后，用ScaI、XhoI雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆產(chǎn)物，獲得的兩個(gè)片段約為1 100 bp和5 000 bp，電泳結(jié)果與理論長(zhǎng)度基本一致（圖1），表明表達(dá)重組質(zhì)粒pET-22b（+）-Bosd5構(gòu)建成功。通過對(duì)酶切成功的pET-22b（+）表達(dá)載體質(zhì)粒進(jìn)行雙向DNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列比對(duì)分析表明，其序列與原始目標(biāo)序列的相似性為100%，可用于后續(xù)蛋白的表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

圖1 pET-22b（+）-Bos d5限制酶切鑒定結(jié)果

2.2 重組蛋白的表達(dá)和純化結(jié)果

將pET-22b（+）-Bos d5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)親和純化后，SDS-PAGE凝膠電泳后如圖2顯示，在20-25 kD左右有明顯條帶，與目標(biāo)大小22.5 kD大小一致，且產(chǎn)物純度大于85%。

圖2 重組Bos d5的SDS-PAGE圖

2.3 LoD檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)過重復(fù)測(cè)定S0樣本20次，代入S0、S1的濃度和發(fā)光值平均值擬合得出的一次方程，計(jì)算得到LOD均小于0.01 IU/mL（表1）。

2.4 方法學(xué)比對(duì)結(jié)果

將生物素化的重組蛋白制備抗體試劑盒，用于測(cè)試110份臨床樣本，并以目前國(guó)際市場(chǎng)上使用較多的Phadia檢測(cè)試劑盒測(cè)得的數(shù)據(jù)作參照，將重組蛋白試劑盒測(cè)得的效價(jià)測(cè)量值與Phadia檢測(cè)試劑盒測(cè)得的數(shù)據(jù)相比較。結(jié)果如圖3所示，在化學(xué)發(fā)光平臺(tái)檢測(cè)的測(cè)量值和Phadia開發(fā)的檢測(cè)試劑盒之間的線性關(guān)系為y = 0.874 1x+ 0.658 2，相關(guān)指數(shù)為R2= 0.829 9?；瘜W(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)和FEIA陽(yáng)性符合率為88.9%（32/36），陰性符合率為97.3%（72/74），總 符 合 率 94.5%（104/110），P＜0.001，χ2=84.238，Kappa=0.874。由此可見本研究制備的重組蛋白試劑盒與Phadia參照試劑盒同樣具有較好的一致性。

表1 LoD測(cè)定結(jié)果

圖3 方法學(xué)比對(duì)圖

3 討論

傳統(tǒng)的牛奶過敏原檢測(cè)大多使用的是天然的過敏原提取物，但天然提取物存在許多缺點(diǎn)［17-19］：在過敏原提取中，致敏與非致敏組分均存在，會(huì)致使提取物中組分復(fù)雜，難得到高純度的單一過敏原組分；提取物中致敏原會(huì)含量不足，且含量以及活性因廠家不同使過敏原難于標(biāo)準(zhǔn)化、不具可比性，不僅不利于食物過敏原的檢測(cè)，也很難找到與特異性IgE抗體相對(duì)應(yīng)的過敏原；天然過敏原提取物在加工提取和貯藏的過程中，其中固有的酶也能導(dǎo)致蛋白降解，導(dǎo)致其生物學(xué)活性降低。此外，傳統(tǒng)的過敏檢測(cè)不能具體區(qū)分和鑒定致敏物中的過敏原與非過敏原，對(duì)過敏原的定量十分有限。組分分析診斷（Component-resolved diagnosis，CRD）技術(shù)是基于分子診斷，使過敏原中的致敏組分分離，精確診斷出使患者產(chǎn)生過敏的組分，對(duì)于過敏原的精確診斷和后續(xù)的脫敏治療具有重要的意義［20-21］。

重組過敏原是過敏原新型免疫治療和診斷方法發(fā)展的基礎(chǔ)，重組獲得的蛋白純度和濃度高，使得自制的重組過敏原研究成本大幅度降低［22-23］。由于重組過敏原具有明確的質(zhì)量、濃度和組成，批次間差異小，可重復(fù)性強(qiáng)，已被廣泛地應(yīng)用于體外診斷試劑的研發(fā)。李建杰等［24］成功地克隆、表達(dá)了牛奶主要過敏原β-乳球蛋白的一個(gè)基因片段，經(jīng)Western Blot和ELISA檢測(cè)具有較好的抗原性，能夠?yàn)楹罄m(xù)牛奶的免疫原性研究提供參考。本研究中利用pET-22b（+）載體和目的基因構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)鑒定與預(yù)期大小相符，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功后，經(jīng)轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、誘導(dǎo)蛋白表達(dá)和SDS-PAGE電泳檢測(cè)顯示，獲得了高效表達(dá)的重組蛋白，為繼續(xù)開展過敏原檢測(cè)新技術(shù)研究提供基礎(chǔ)材料。

IgE在人體內(nèi)的含量?jī)H為IgG的1/40 000，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法難以在靈敏度和特異性方面達(dá)到要求，建立高靈敏度的檢測(cè)方法尤為必要?；诟咝б合嗌V法、超高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫吸附法、免疫層析法、電化學(xué)免疫法、蛋白微陣列法、等離子體共振法等色譜學(xué)和免疫學(xué)方法均可用于牛奶中β-乳球蛋白的微量檢測(cè)［25-26］。食物激發(fā)試驗(yàn)是大眾公認(rèn)的診斷食物過敏的黃金標(biāo)準(zhǔn)，SPT（Skin prick test）提供了一種快速檢測(cè)IgE抗體的方法［27］。SPT雖然靈敏度高，但特異性較低，尚不能作為食物過敏的確診依據(jù)，更不能確診是哪種組分。SPT、食物sIgE檢測(cè)適用于速發(fā)型牛奶過敏，兩者聯(lián)合可增加診斷的準(zhǔn)確性。隨著年齡的增長(zhǎng)，牛奶蛋白sIgE抗體的臨界值點(diǎn)也相應(yīng)增加，需根據(jù)患者年齡特點(diǎn)，選擇適宜的診斷閾值，因而一個(gè)合適的檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè)效果有很大的影響［28］。布冠好［29］建立了定量檢測(cè)牛乳β-乳球蛋白的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，檢測(cè)范圍在0.05-1 μg/mL之間。ELISA技術(shù)在目前市場(chǎng)上已有多種針對(duì)牛奶過敏原檢測(cè)的商業(yè)試劑盒，可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)牛奶過敏原的定性或半定量檢測(cè)，但存在線性范圍窄的缺點(diǎn)，不能精確定量，對(duì)后續(xù)的脫敏治療沒有很好地指導(dǎo)作用。賈敏等［30］建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法可應(yīng)用于食品中牛奶過敏原β-乳球蛋白質(zhì)的檢測(cè)，其需要對(duì)牛奶基因組DNA進(jìn)行提取，步驟相對(duì)繁瑣，且不能檢測(cè)血液中的sIgE，不利于后續(xù)脫敏治療。本實(shí)驗(yàn)是基于堿性磷酸酶標(biāo)記技術(shù)的化學(xué)發(fā)光體系，靈敏度比RIA或ELISA大3-5個(gè)數(shù)量級(jí)，血清檢測(cè)取得了相較其他反應(yīng)體系更高的陰陽(yáng)性樣本比值，以及更大的線性檢測(cè)范圍，達(dá)到過敏原項(xiàng)目靈敏度檢測(cè)高的目的。

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，過敏原的檢測(cè)向高靈敏度、高準(zhǔn)確度、高通量、操作簡(jiǎn)單方向發(fā)展。納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫診斷技術(shù)是磁微粒載體技術(shù)和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)的結(jié)合，以復(fù)合材料表面標(biāo)記蛋白為基礎(chǔ)，具有放射污染微小、自動(dòng)化、檢測(cè)范圍廣、靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)［10-12］。本研究中，將制備的重組蛋白Bosd5利用生物素標(biāo)記純化后，與納米磁微粒上的鏈霉親和素進(jìn)行偶聯(lián)以形成固定抗原，在納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光平臺(tái)上驗(yàn)證。使用重組蛋白開發(fā)的試劑盒檢測(cè)臨床樣本，靈敏度以及特異性與國(guó)外的試劑盒（Phadia的試劑盒）檢測(cè)結(jié)果的符合率較高，對(duì)比圖的線性較好，蛋白的靈敏度高、特異性強(qiáng)，說明制備的重組牛奶過敏原蛋白符合開發(fā)試劑盒的性能指標(biāo)，可以用于后續(xù)研究和臨床檢測(cè)。

4 結(jié)論

構(gòu)建牛奶過敏原Bosd5原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)了特異性和效價(jià)優(yōu)良的重組β-乳球蛋白，β-乳球蛋白生物素化后作為規(guī)模化生產(chǎn)牛奶β-乳球蛋白過敏原檢測(cè)試劑盒的基礎(chǔ)材料，適用于全自動(dòng)納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)。