杜迎剛，季清娥，賴鐘雄

(1.濰坊科技學(xué)院 山東省高校設(shè)施園藝實驗室，山東 壽光 262700;2.福建農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶果樹研究所，福建 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué) 植保學(xué)院，福建 福州 350002)

南亞實蠅Bactroceratau(Walker)，屬雙翅目(Diptera)實蠅科(Tephritidea)果實蠅屬(BactroceraMacquart)，為害絲瓜、南瓜、苦瓜等13種瓜類，柑橘、杧果等共計70多種熱帶和亞熱帶瓜果，在中國大陸地區(qū)主要分布于廣東、廣西、海南、福建、云南、貴州、四川、湖北、浙江、江西等地，且為害面積逐年擴大，加上其抗逆性強，個體食量大，發(fā)育歷期短，產(chǎn)卵期長，給當(dāng)?shù)氐乃褪卟松a(chǎn)造成巨大經(jīng)濟損失[1-2]，甚至在很多地區(qū)其危害已超過橘小實蠅B.dorsalis(Hendel)和瓜實蠅B.cucuribitae(Coquillett).

嗅覺在昆蟲寄主定位與選擇、產(chǎn)卵等行為中發(fā)揮著感知寄主植物揮發(fā)物、昆蟲信息素等氣味信息物質(zhì)的重要作用.對昆蟲的嗅覺識別進行有效干擾，是實現(xiàn)害蟲可持續(xù)治理極有潛力的一條途徑[3].這種方法從很久以前在實蠅防治和監(jiān)控上就已發(fā)揮著重要作用[4]，在很多地區(qū)甚至是唯一的防治措施.但在防治過程中發(fā)現(xiàn)引誘劑(主要指甲基丁香酚(methyl eugenol，簡稱ME)和誘蠅酮(cuelure，簡稱CUE)這兩種副信息素[4])取食經(jīng)歷會對正常實蠅、輻照不育實蠅的交配行為和其對引誘劑的趨性行為產(chǎn)生很大影響[5-6].還有，引誘劑在野外開放環(huán)境條件下誘集不到雌蠅，但在室內(nèi)籠中卻誘集到15%左右的雌蠅[7-8].為科學(xué)指導(dǎo)引誘劑在實蠅監(jiān)控和防治上的應(yīng)用，筆者首次以對兩種主要實蠅類昆蟲引誘劑——甲基丁香酚和誘蠅酮都具趨性反應(yīng)的南亞實蠅[9]為研究對象，對其氣味結(jié)合蛋白(odorant-binding protein，簡稱OBP)整個家族基因進行篩選和克隆驗證.

1 材料與方法

1.1 材 料

南亞實蠅為福建農(nóng)林大學(xué)益蟲研究所2013年建立的室內(nèi)大量飼養(yǎng)種群，初始種群采自漳州，為害絲瓜，該實驗所用種群為同地點同類寄主上野生蟲源連續(xù)復(fù)壯3次后的蟲源.轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫為該種群不同狀態(tài)下(正常飼養(yǎng)、輻照處理、CUE/ME誘導(dǎo)的南亞實蠅在1日齡(對ME有觸角電位反應(yīng)，但沒趨性[7])、5日齡(對ME開始有趨性反應(yīng)，但性未成熟)、10日齡(性成熟、交配前后)、17日齡(產(chǎn)卵后)、19日齡(部分實蠅開始出現(xiàn)二次交配))的混合樣品，委托“北京百邁客生物科技有限公司”建立合格數(shù)據(jù)庫[10].用于基因克隆的RNA為轉(zhuǎn)錄組測序剩余樣品.

1.2 方 法

1.2.1 氣味結(jié)合蛋白相關(guān)基因的篩選

用OBP/odorant-binding protein，PBP/pheromone-binding protein，ABPX /antennal-binding protein X，OB-PRPs /OBP-like/odorant binding protein-like為關(guān)鍵詞在轉(zhuǎn)錄組注釋數(shù)據(jù)庫中進行unigene篩選，將這些候選unigene序列與NCBI登陸的相關(guān)序列進行比對分析，初步篩選出南亞實蠅OBPs序列.

1.2.2 引物設(shè)計與合成

基于初步篩選出的南亞實蠅OBPs序列，各設(shè)計一對3′端引物和一對5′端引物，所用引物均為北京六合華大基因科技股份有限公司合成，見表1.

表1 南亞實蠅OBPs基因克隆的引物列表

續(xù)表1

續(xù)表1

1.2.3 基因克隆

以轉(zhuǎn)錄組測序剩余的RNA為模板，用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas, EU)試劑逆轉(zhuǎn)錄的cDNA用于保守區(qū)及3′非編碼區(qū)(3′UTR)的擴增；用SMARTTMRACE cDNA Amplification kit(Takara,China)試劑逆轉(zhuǎn)錄的cDNA用于5′非編碼區(qū)(5′UTR)的擴增.所用PCR體系為25 μL，擴增程序和體系參照林麗霞等[11]的方法，退火溫度根據(jù)引物的Tm值做適當(dāng)調(diào)整，延伸時間按照1 kb需1 min的原則根據(jù)目的片段長度進行調(diào)整.PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.0%瓊脂糖凝膠電泳驗證后，用EzgeneTMGel/PCR Extraction kit(BIOMIGA)試劑盒進行目的條帶的回收純化，然后連接T載體，轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布于含100 mg·L-1氨芐霉素的 LB培養(yǎng)基中37 ℃黑暗倒置培養(yǎng)約12 h后，挑取單克隆搖菌后以M13F、M13R為引物進行PCR檢測，選取陽性克隆菌液送北京六合華大基因科技股份有限公司測序.

1.2.4 序列分析和進化樹構(gòu)建

對測序得到的基因序列進行Blastx比對去載體，用 DNAMAN 6.0軟件拼接后，得到該基因的 cDNA全長.然后用DNAMAN軟件對獲得的OBPs序列進行分析.

對NCBI、公共數(shù)據(jù)庫進行檢索，下載黑腹果蠅Drosophilamelanogaster、瓜實蠅B.cucuribitae、地中海實蠅Ceratitiscapitata、橘小實蠅B.dorsalis已公開發(fā)表的OBPs序列，用MEGA 5.0的neighbor-Joining方法構(gòu)建OBPs家族的系統(tǒng)進化樹.

2 結(jié)果與分析

2.1 南亞實蠅OBPs的克隆鑒定

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫搜索共得到OBPs候選基因32條，進一步克隆驗證得到OBPs家族基因cDNA 全長26條，見表2.OBPs的典型特征是在二級序列中存在形成 3 對二硫鍵的6 個保守的半胱氨酸(Cys)殘基[12]，根據(jù)Cys的數(shù)目及位置，OBPs分為Minus-OBPs、“Dimer”O(jiān)BPs、非典型 OBPs(Atypical OBPs)、“Plus-C”O(jiān)BPs和典型 OBPs (Classical OBPs)5種主要類型[13].結(jié)構(gòu)分析表明，BtauOBP16和BtauOBP22氨基酸序列缺少第2和第5個Cys殘基，屬于Minus-OBPs[13]；BtauOBP24包含兩個類似于典型 OBP 的6個保守的Cys結(jié)構(gòu)，為“Dimer”O(jiān)BPs；BtauOBP15與“Plus-C”O(jiān)BPs的結(jié)構(gòu)式Cys-X8-41-Cys-X3-Cys-X39-47Cys-X17-29-Cys4a-X9-Cys-X8-Cys-Pro-X9-11-Cys6a[14]或Cys-X20-41-Cys-X3-Cys-X41-46-Cys-X19-29-Cys4a-X9-Cys-X8-Cys-Pro-X9-10-Cys6a-X9-10[13,15]相吻合，為“Plus-C”O(jiān)BPs；BtauOBP9雖包含 9個Cys，但與非典型 OBPs的結(jié)構(gòu)式Cys-X26-27-Cys-X3-Cys-X36-38-Cys-X11-15-Cys-X8-Cys[13,16]不吻合，與黑腹果蠅中僅“Plus-C”O(jiān)BPs中Cys5與Cys6之間被9個氨基酸殘基隔開的特征吻合[15]，認為其為“Plus-C”O(jiān)BPs；其余OBPs都包含6個Cys殘基，且符合 Cys-X20-66-Cys-X3-Cys-X21-43-Cys-X8-14-Cys-X8-Cys,Cys-X15-39-Cys-X3-Cys-X21-44-Cys-X7-12-Cys-X8-Cys 或X22-68-Cys-X25-68-Cys-X3-Cys-X31-46-Cys-X8-29-Cys-X8-9-Cys-X5-71[15]的結(jié)構(gòu)特點，為典型 OBPs，見圖1所示.

表2 南亞實蠅氣味結(jié)合蛋白基因與最匹配的瓜實蠅氣味結(jié)合蛋白基因比較

圖1 已克隆的南亞實蠅OBPs的序列比對圖

2.2 南亞實蠅OBPs的同源性分析

通過與NCBI、公共數(shù)據(jù)庫進行比對，成功克隆的南亞實蠅OBPs序列和瓜實蠅的OBPs序列表現(xiàn)出高度保守性，如表2所示：僅有3條OBPs的相似度低于95%，分別為BtauOBP2-a (93%),BtauOBP5(92%),BtauOBP15(89%).

2.3 南亞實蠅OBPs的進化分析

用MEGA5.0軟件對這26條OBPs序列與黑腹果蠅D.melanogaster(58條)、瓜實蠅B.cucuribitae(34條)、地中海實蠅C.capitata(28條)、橘小實蠅B.dorsalis(47條)OBPs序列進行進化樹構(gòu)建，1 000次重復(fù)的結(jié)果表明：南亞實蠅OBPs序列中有16條與瓜實蠅OBPs聚類數(shù)值達90以上，說明南亞實蠅與瓜實蠅親緣關(guān)系最近(圖2).

●表示BtauOBPs；○表示DemlOBPs；▲表示BcucOBPs；圖中分支點的數(shù)字表示Bootstrap驗證中基于1 000次重復(fù)該節(jié)點可信度的百分比(%).圖2 MEGA5.0構(gòu)建的南亞實蠅與黑腹果蠅、地中海實蠅、橘小實蠅、瓜實蠅OBPs的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

3 結(jié)論與討論

伴隨著高通量測序技術(shù)在昆蟲上的應(yīng)用[17-18]和轉(zhuǎn)錄組測序成本的降低，對昆蟲OBPs的研究得到迅速發(fā)展.就實蠅而言，得益于黑腹果蠅D.melanogaster全基因測序[19-20]的完成及其51個嗅覺和味覺基因的報道[15]，在地中海實蠅[21]、蘋果實蠅、美國核桃實蠅[22]、橘小實蠅[23-24]等實蠅種類上OBPs的研究都得到了較大進展，但對南亞實蠅這一中國危害較嚴重的4種實蠅(橘小實蠅B.dorsalis、瓜實蠅B.cucuribitae、南亞實蠅B.tau、柑橘大實蠅B.minax(Enderlein))中唯一對CUE、ME都有趨性反應(yīng)的實蠅卻缺乏相關(guān)研究.筆者首次從南亞實蠅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出32條OBPs候選基因，并成功克隆驗證出26條，這為下一步研究其OBPs的高級結(jié)構(gòu)和功能提供了條件.同源性分析表明，南亞實蠅OBPs與瓜實蠅OBPs同源性很高，與南亞實蠅對瓜實蠅引誘劑CUE[8]和信息素[25]產(chǎn)生強烈行為反應(yīng)的研究一致，此為下一步南亞實蠅、瓜實蠅引誘劑的改進提供了理論依據(jù)，但兩種實蠅無論形態(tài)特征還是寄主譜等都差異很大，這說明要了解實蠅復(fù)雜的嗅覺機制只研究氣味結(jié)合蛋白是遠遠不夠的，也解釋了為什么自CUE/ME后實蠅引誘劑沒有實質(zhì)性突破的原因.

昆蟲氣味結(jié)合蛋白(OBPs)是廣泛分布于昆蟲觸角感器淋巴液中的一種低分子量的水溶性蛋白[12]，昆蟲對寄主植物揮發(fā)物、信息素等化學(xué)信號的感受，主要通過其還原型與氣味分子發(fā)生特異性結(jié)合，而將外界疏水性的氣味分子運載到嗅覺神經(jīng)樹突膜上的感覺受體(olfactory receptor，簡稱OR)來實現(xiàn)[26].根據(jù)配體差異將OBPs分為GOBP/PBP,CRLBP(chemical-sense-related lipophilic-ligand-binding protein),ABPX(antennal-binding protein X)3類[13].從圖2聚類分析可以看出，BtauOBP3,BtauOBP10,BtauOBP13,BtauOBP20與CRLBP亞類的DemlOBP19d,DemlOBP28a[15]聚在一起，屬于CRLBP亞類；BtauOBP23,BtauOBP2-a,BtauOBP26與ABPX亞類的DemlOBP83a,DemlOBP83b[15]聚在了一起，屬于ABPX亞類.BtauOBP9在進化分析中與黑腹果蠅中具有“Plus-C”結(jié)構(gòu)的DemlOBP84a聚在一起，這與結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致；同時，結(jié)構(gòu)差異很大的BtauOBP8也與黑腹果蠅中具有“Plus-C”結(jié)構(gòu)的DemlOBP84a聚在一起，說明要全面了解BtauOBPs的功能必須對其結(jié)構(gòu)進行深入研究，這也是筆者后續(xù)要研究的內(nèi)容.