王菲迪,王莉,吳聲敢,蔣金花,柳新菊,安雪花,呂露,趙學(xué)平
(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所 省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(籌)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥殘留檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310021)
14-羥基蕓苔素甾醇是一種結(jié)構(gòu)新穎的油菜素甾醇(Brassinosteroid,BRs)激素。BRs是一類多羥基的類固醇植物激素,被譽(yù)為繼生長(zhǎng)素、乙烯、脫落酸、赤霉素、細(xì)胞分裂素后的第六類植物內(nèi)源性激素[1]。BRs能夠調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育,具有高效、廣譜、無(wú)毒的特點(diǎn),在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛[1]。14-羥基蕓苔素甾醇制備時(shí)主要以花粉為原料,采用酶法水解萃取進(jìn)行提取、分離和純化,具有良好的蕓苔素內(nèi)酯活性[1]。14-羥基蕓苔素甾醇分子式為C27H46O7,化學(xué)名稱為(20R,22R)-2β,3β,14,20,22,25-六羥基-5β-6-酮。包括14-羥基蕓苔素甾醇在內(nèi)的BRs分子中缺乏對(duì)光、電高響應(yīng)的官能團(tuán),且揮發(fā)性差,較難離子化[2]。檢測(cè)時(shí),最常見的思路是利用甾醇分子中特征的順式鄰二羥基與烴基硼酸結(jié)合,引入生色團(tuán)或電活性基團(tuán),再利用質(zhì)譜、紫外、熒光或電化學(xué)檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)[2]。衍生化操作繁瑣,不經(jīng)衍生化直接用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(HPLC-ELSD)可對(duì)14-羥基蕓苔素甾醇直接進(jìn)行檢測(cè)。吳進(jìn)龍等[3]以萘硼酸為衍生化試劑,以甲醇為溶劑進(jìn)行衍生化反應(yīng),采用HPLC-DAD對(duì)衍生化產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),此法定量限(LOQ)為25.0 mg·L-1。其團(tuán)隊(duì)還采用HPLC-ELSD對(duì)14-羥基蕓苔素甾醇直接進(jìn)行檢測(cè),LOQ為16.1 mg·L-1[4]。根據(jù)報(bào)道,其他種類蕓苔素甾醇的分析方法也通常著眼于生物檢測(cè)、衍生化分析和免疫分析等手段,但生物檢測(cè)穩(wěn)定性差,難以準(zhǔn)確定量,衍生化方法操作繁瑣,免疫分析成本高,且高度轉(zhuǎn)移[2]。而超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法(UPLC-MS/MS)具有高效、分離度高、靈敏度高等特點(diǎn),是蕓苔素甾醇檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的一個(gè)趨勢(shì)。本研究通過UPLC-MS/MS,建立更靈敏、選擇性更高的分析方法,旨在為蕓苔素甾醇的分析檢測(cè)提供一定的研究思路。
ABSciex液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(Exion LCAD-Triple QuadTM 5500,美國(guó)ABSciex公司);CORTECS?UPLC?HILIC色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.6 μm,美國(guó)Waters公司);BSA224S 電子天平(感量0.000 1 g,德國(guó)賽多利斯集團(tuán));MX-S可調(diào)式混勻儀(北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。
14-羥基蕓苔素甾醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.0%,成都新朝陽(yáng)作物科學(xué)有限公司);色譜純乙腈(德國(guó)Merck公司);色譜純甲酸和色譜純乙酸銨(Anaqua Chemicals Supply公司);飲用純凈水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。
準(zhǔn)確稱取適量14-羥基蕓苔素甾醇標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈溶解,配成濃度為1.19×103mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,再用乙腈逐級(jí)稀釋,得到濃度為10.000、0.500、0.200、0.100、0.050、0.010和0.005 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液。
1.3.1 樣品前處理
取5.0 mL水樣,加入5.0 mL乙腈,渦旋1 min混勻。用乙腈將混勻后的溶液稀釋5倍,過0.22 μm濾膜,待分析。
1.3.2 檢測(cè)條件
液相條件。色譜柱CORTECS?UPLC?HILIC色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.6 μm,美國(guó)Waters公司)。流動(dòng)相:A為0.1%甲酸+2 mmol·L-1乙酸銨水溶液,B為乙腈。梯度洗脫程序:起始比例A為5%;0~0.5 min,A維持5%;0~0.5 min,A升至30%,然后維持至3.5 min;3.5~4.0 min,恢復(fù)至起始梯度平衡系統(tǒng),維持至6.0 min。流速0.25 mL·min-1;柱溫40 ℃;進(jìn)樣體積5.00 μL;峰面積外標(biāo)法定量。
質(zhì)譜條件。毛細(xì)管電壓-4.5 kV,氣簾氣35 psi,噴撞氣7 psi,噴霧氣50 psi,輔助加熱氣50 psi,離子源溫度550 ℃,射入電壓-10 V,碰撞室射出電壓-16 V。定性、定量模式均為MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式,電離方式為ESI-。14-羥基蕓苔素甾醇的定量離子對(duì)(去簇電壓、碰撞能)為m/z541.2>159.2(-100 V,-40 V),定性離子對(duì)(去簇電壓、碰撞能)為m/z541.2>347.5(-100 V,-36 V)。
14-羥基蕓苔素甾醇分子中缺乏對(duì)光、電高響應(yīng)的官能團(tuán),較難離子化,因此質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)母離子和子離子的確定很困難。分別在ESI+和ESI-兩種電離方式下對(duì)14-羥基蕓苔素甾醇的母離子進(jìn)行掃描,最終確認(rèn)母離子為[M+CH3COO-]的離子,常見的[M+H+]和[M+Na+]等信號(hào)均較弱,然后確定子離子,優(yōu)化了碰撞能量、去簇電壓等參數(shù)。
分別考察ACQUITY UPLCTMBEH C18色譜柱、CORTECS?UPLC?HILIC色譜柱及ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱對(duì)14-羥基蕓苔素甾醇的分離分析性能。14-羥基蕓苔素甾醇極性較大,在ACQUITY UPLCTMBEH C18色譜柱和ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱上基本無(wú)保留,1 min內(nèi)就出峰,且穩(wěn)定性差,故最終選擇適合分離分析極性化合物的CORTECS?UPLC?HILIC色譜柱。
考察乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸+2 mmol·L-1乙酸銨水溶液、乙腈-2 mmol·L-1乙酸銨水溶液及甲醇-2 mmol·L-1乙酸銨水溶液等流動(dòng)相對(duì)14-羥基蕓苔素甾醇的色譜峰形和響應(yīng)值的影響。最終確定流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸+2 mmol·L-1乙酸銨水溶液,在該流動(dòng)相體系下,色譜峰形相對(duì)較好且穩(wěn)定。
分別采用了乙酸乙酯提取、二氯甲烷提取、乙腈提取和乙腈定容的方法進(jìn)行了添加回收試驗(yàn)。結(jié)果表明,乙酸乙酯提取、二氯甲烷提取和乙腈提取方法的回收率均較低,未能滿足農(nóng)藥檢測(cè)要求,而乙腈定容后再稀釋的方法的添加回收率滿足檢測(cè)要求。因此,最終選擇了乙腈定容的前處理方法對(duì)14-羥基蕓苔素甾醇進(jìn)行檢測(cè)。
將0.005、0.010、0.050、0.100和0.200 mg·L-1的14-羥基蕓苔素甾醇標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)儀器進(jìn)行檢測(cè)。以濃度為橫坐標(biāo),分別對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù),得到回歸方程為y=279 012x+1 521,相關(guān)系數(shù)R2=0.992 7,表明14-羥基蕓苔素甾醇在0.005~0.200 mg·L-1濃度線性良好。
在不含14-羥基蕓苔素甾醇的空白水樣中,通過添加回收試驗(yàn),考察了方法的準(zhǔn)確度和精密度(n=5)。表1表明,14-羥基蕓苔素甾醇在0.1、1.0、11.9 mg·L-1添加水平下,平均回收率在101%~106%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.29%~5.82%,滿足檢測(cè)分析的要求。根據(jù)添加回收,確定14-羥基蕓苔素甾醇的定量限(LOQ)為0.1 mg·L-1。
表1 14-羥基蕓苔素甾醇的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差
本研究建立了14-羥基蕓苔素甾醇的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法,該方法簡(jiǎn)單、快速、高效、靈敏,檢出限最低可到0.1 mg·L-1,能夠滿足14-羥基蕓苔素甾醇?xì)埩袅康臋z測(cè)要求,為蕓苔素甾醇的分析方法提供了一定的研究思路。但今后仍需發(fā)展更為靈敏的檢測(cè)方法,如發(fā)展操作簡(jiǎn)易、響應(yīng)靈敏的新型衍生化試劑,與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜相結(jié)合,為蕓苔素甾醇這類新型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控提供強(qiáng)有力的支持。