鐘 珊 , 王小慶 ,馬保華, 鄒永德 , 廖新俤, 楊江鴻, 吳銀寶，2*

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部華南熱帶農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642；3. 南海出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 佛山 528200)

磺胺類獸用抗生素在畜禽養(yǎng)殖中常作為飼料添加劑用以預(yù)防疾病和促生長(zhǎng)，但由此也導(dǎo)致畜禽糞尿中磺胺類獸用抗生素殘留。在上海市多個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)采集到的糞便和土壤中，磺胺二甲嘧啶(SMZ)的檢出濃度范圍為1.29～8.01 mg/kg[1]。Pan等[2]在豬糞中也檢測(cè)到SMZ的濃度為28.7 mg/kg。由于獸用抗生素普遍具有廣譜抗菌性，其隨畜禽糞污進(jìn)入?yún)捬跸到y(tǒng)就會(huì)影響厭氧消化系統(tǒng)的功能，同時(shí)還需要關(guān)注獸用抗生素的降解產(chǎn)物在厭氧消化系統(tǒng)中的殘留[3-4]。N4-ACE-SM2是SMZ在動(dòng)物體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物，它可以與SMZ一同隨動(dòng)物的糞尿排泄到環(huán)境中，對(duì)環(huán)境造成潛在的威脅[5]。目前對(duì)于獸用抗生素對(duì)豬糞厭氧消化的影響研究多采用直接加入法[6-9]。已有研究表明，對(duì)于泰樂菌素和金霉素，在相同試驗(yàn)條件下，體內(nèi)代謝法和直接加入法所得結(jié)果不同[10-11]。對(duì)于SMZ是否也存在類似結(jié)果，目前尚未有相關(guān)研究。由此，本研究經(jīng)體內(nèi)代謝法和直接加入法研究了SMZ對(duì)豬糞厭氧消化系統(tǒng)的影響，可為評(píng)價(jià)獸用抗生素對(duì)厭氧消化系統(tǒng)的影響及其生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

SMZ原料藥購自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)華天獸藥廠，SMZ標(biāo)準(zhǔn)品購自中國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)。隨機(jī)選取30頭33 kg左右的長(zhǎng)大二元雜母豬，預(yù)飼期為2周，日糧中不添加任何獸藥，臨床無異常后進(jìn)入正式試驗(yàn)期。正式試驗(yàn)分為空白組和試驗(yàn)組，每組15頭。空白組所飼喂飼料中不添加任何獸用抗生素；試驗(yàn)組在飼料中添加SMZ，添加量為200 mg/kg飼料，首次量加倍，用藥期為7 d。收集用藥期內(nèi)空白組和試驗(yàn)組的豬糞，經(jīng)檢測(cè)SMZ濃度和其代謝產(chǎn)物N4-ACE-SM2濃度后用于厭氧消化試驗(yàn)。選取含SMZ最高和最低的豬糞用于厭氧消化試驗(yàn)，以反應(yīng)生產(chǎn)實(shí)踐中SMZ在豬糞中的平均殘留水平。

1.2 試驗(yàn)裝置

模型厭氧消化系統(tǒng)為有效容積1 300 mL的三口玻璃燒瓶[12]，三個(gè)出口均采用橡膠塞封嚴(yán)，頂部橡膠塞鉆出輸氣孔與吸收瓶相連，側(cè)邊出口分別用于取發(fā)酵液樣和加入新鮮豬糞樣。吸收瓶和集液瓶采用500 mL廣口瓶，吸收瓶用橡膠塞封口。吸收瓶橡膠塞上鉆孔連接玻璃和橡膠管路，用于導(dǎo)出厭氧消化所產(chǎn)生的氣體及吸收瓶中的液體。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

厭氧消化試驗(yàn)設(shè)4個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)組依據(jù)兩種加入方式和兩種加入濃度分為4個(gè)處理組，兩種加入方式分別為經(jīng)體內(nèi)代謝組(即在飼料中添加SMZ經(jīng)體內(nèi)代謝后所收集的含SMZ和N4-ACE-SM2的豬糞)和直接加入組(即加入空白豬糞和相應(yīng)濃度SMZ)，兩種加入濃度分別為56.04 mg/kg 干豬糞(所獲豬糞中SMZ最高濃度)和47.10 mg/kg干豬糞(所獲豬糞中SMZ最低濃度)。經(jīng)檢測(cè)其代謝產(chǎn)物N4-ACE-SM2濃度分別為29.20 mg/kg 和17.80 mg/kg。試驗(yàn)分組如表1所示。厭氧消化溫度設(shè)定為30 ℃。

正式厭氧消化試驗(yàn)開始前，先在模型厭氧消化系統(tǒng)中加入固體率為10%的豬糞污水900 mL，接種100 mL成熟沼液，系統(tǒng)中剩余空間用氮?dú)馓顫M。待厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)氣穩(wěn)定后，開始進(jìn)行正式試驗(yàn)。

正式試驗(yàn)時(shí)間為28 d，其中前7 d為加藥期，后21 d為停藥期，直至系統(tǒng)中檢測(cè)不出獸藥原形及其主要代謝產(chǎn)物殘留時(shí)停止試驗(yàn)。每天8:00先從系統(tǒng)中取出100 mL混勻的沼液，然后CK組試驗(yàn)全期每天均加入100 mL固體率為10%的空白豬糞污水；A1～B2組加藥期分別加入100 mL固體率為10%的含SMZ的豬糞污水，停藥期加入100 mL固體率為10%的空白豬糞污水。試驗(yàn)期內(nèi)系統(tǒng)沼液總體積保持不變。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 SMZ和N4-ACE-SM2濃度 取10 mL沼液沼渣混合物，加入10 mL 0.01 mol/L Na2EDTA的Mcl-Vaine液，漩渦混合30s，超聲10 min，4 ℃ 13 000 r/min離心10 min，上清液倒入另一干凈離心管中，沉淀中加入5 mL提取液，重復(fù)上述步驟再次提取，混合兩次上清液，4 ℃ 13 000 r/min的速度離心5 min，取上清液過固相萃取小柱。固相萃取小柱先用1 mL甲醇激活，1 mL水平衡，然后將上清液過柱，使藥物吸附在萃取小柱上，加水3 mL清洗小柱，頂空1 min，然用0.5 mL甲醇和0.5 mL 2%甲酸甲醇溶液洗脫。洗脫液用0.22 μm濾膜過濾后，用于高效液相色譜儀檢測(cè)。

SMZ色譜條件：紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm；色譜柱采用Kromasil C18 柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm，100 A)；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相為乙腈：5%冰醋酸(12:88)；流速1.0 mL/min；檢測(cè)限0.1 μg/mL；回收率75%。在上述檢測(cè)條件下，能將沼液沼渣中SMZ與其它物質(zhì)分開，其保留時(shí)間為15.250 min。

N4-ACE-SM2色譜條件：紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)262 nm；色譜柱采用Kromasil C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，100 A)；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相，乙腈：0.5M磷酸氫二鉀=15：85；流速1.0 mL/min；檢測(cè)限0.1 μg/mL；回收率72%。在上述檢測(cè)條件下，能將沼液沼渣中N4-ACE-SM2與其它物質(zhì)分開，其保留時(shí)間為8.957 min。

1.4.2 產(chǎn)甲烷量 采用排水法計(jì)算甲烷產(chǎn)量[13]。

1.4.3 產(chǎn)甲烷菌多樣性 采用OMEGA 公司E.Z.N.A. Soil DNA Kit 試劑盒提取沼液沼渣中細(xì)菌基因組DNA，對(duì)其進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增。引物對(duì)為：A934F 5'-AGG AAT TGG CGG GGG AGC A-3'和1390r 5'-ACG GGC GGT GTG TCA A-3')，其中在1390r的5'端加入33個(gè)GC夾(5'-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GGC GGG GGC ACG GGC GGT GTG TCA A-3')，以增加產(chǎn)物的穩(wěn)定和片段的分離。所得PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并照像。采用BIO-RAD DCodeTM Universal Mutation Detection System(基因突變檢測(cè)系統(tǒng))對(duì)細(xì)菌PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)分析。使用Quantity One軟件分析DGGE圖譜，并計(jì)算Shannon's多樣性指數(shù)H＇，計(jì)算公式為：

式中：H＇為Shannon's多樣性指數(shù)，H＇值越大說明樣品的多樣性程度越高；s為每個(gè)泳道條帶數(shù)；Pi為每個(gè)條帶強(qiáng)度占總條帶強(qiáng)度的比例。

利用Phroetix-1D(Totallb)和Phroetix-1D Pro(Totallb)軟件對(duì)DGGE電泳圖譜進(jìn)行相似性分析，得到各個(gè)泳道間的相似性指數(shù)，即戴斯系數(shù)(Dice Coefficient，Cs)，根據(jù)Cs得到各個(gè)泳道相似性系數(shù)矩陣圖，用非加權(quán)組平均法(Unweighted Pair Group Mean Average，UPGMA)將相似性系數(shù)矩陣轉(zhuǎn)化為相似性聚類樹狀圖，然后對(duì)聚類樹狀圖進(jìn)行分析。在聚類樹狀圖中的Distance表示泳道間條帶差異性，當(dāng)Distance為0時(shí)表示差異性為0，泳道間的條帶完全相同，當(dāng)Distance為1時(shí)則相反，表示差異性為1，泳道間的條帶完全不同。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用鄧肯極差檢驗(yàn)法，顯著水平P值設(shè)為0.05，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 SMZ及N4-ACE-SM2濃度在厭氧消化系統(tǒng)中的變化規(guī)律

由表2可知，隨著含SMZ豬糞的加入，厭氧消化系統(tǒng)中SMZ濃度一直呈上升趨勢(shì)，這可能使由于厭氧消化系統(tǒng)對(duì)其的降解量小于系統(tǒng)中SMZ的加入量。7 d加藥期結(jié)束時(shí)，除CK組未檢出SMZ外，A1、B1、A2和B2組系統(tǒng)中SMZ的濃度分別為0.91、0.81、0.72、0.73 mg/L。進(jìn)入停藥期后，系統(tǒng)中SMZ濃度快速下降，在停藥期第4天(試驗(yàn)第11天)時(shí)，各試驗(yàn)組SMZ濃度已經(jīng)降至加藥期結(jié)束時(shí)濃度的50%左右，但之后SMZ降解速度變緩，直至停藥期第21天(試驗(yàn)第28天)時(shí)，各試驗(yàn)組才檢測(cè)不出SMZ殘留，由于本研究采用動(dòng)態(tài)進(jìn)出樣，不斷有SMZ隨沼液沼渣排出到系統(tǒng)外，SMZ在系統(tǒng)中也被逐步降解，濃度下降。各試驗(yàn)組系統(tǒng)中SMZ濃度差異不顯著(P>0.05)，且變化趨勢(shì)相同。

表2 厭氧消化系統(tǒng)中SMZ與N4-ACE-SM2的濃度變化Table 2 The concentration of SMZ and N4-ACE-SM2 in anaerobic digestion system mg/L

SMZ在豬體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物為N4-ACE-SM2[5]，本研究測(cè)定了各試驗(yàn)組厭氧消化系統(tǒng)中N4-ACE-SM2的濃度。由表2可知，在加藥期系統(tǒng)中N4-ACE-SM2濃度呈上升趨勢(shì)，這表明隨著含SMZ豬糞的加入，系統(tǒng)中N4-ACE-SM2濃度也逐步累積。進(jìn)入停藥期后，厭氧消化系統(tǒng)中的N4-ACE-SM2濃度逐步下降，在試驗(yàn)第25天，各試驗(yàn)組厭氧消化系統(tǒng)中均未檢出N4-ACE-SM2殘留。B1組和B2組所用空白豬糞中不含N4-ACE-SM2，但系統(tǒng)中同樣檢測(cè)到該物質(zhì)，表明N4-ACE-SM2不僅可以經(jīng)體內(nèi)代謝產(chǎn)生，而且也可在厭氧消化系統(tǒng)中分解產(chǎn)生。方差分析表明，不論在加藥期、停藥期還是在整個(gè)試驗(yàn)期，N4-ACE-SM2的濃度在各試驗(yàn)組間差異不顯著(P>0.05)，濃度變化趨勢(shì)也相似。

2.2 SMZ對(duì)厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量的影響

由表3可見，在試驗(yàn)濃度條件下，加藥期A1、B1、A2和B2組分別與CK相比，系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量無顯著差異(P>0.05)。但采用經(jīng)體內(nèi)代謝法的A1組和A2組產(chǎn)甲烷量分別比同濃度的直接加入法的B1組和B2組顯著降低了17.36%和23.60%(P<0.05)。說明加藥期經(jīng)體內(nèi)代謝法抑制了產(chǎn)甲烷量。停藥期B1組和B2組產(chǎn)甲烷量顯著低于CK組、A1組和A2組(P<0.05)，B1組和B2組產(chǎn)甲烷量比A1組和A2組顯著降低了13.79%和16.34%。這說明停藥期直接加入法抑制了產(chǎn)甲烷量。

表3 SMZ對(duì)厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量的影響Table 3 Effect of SMZ on the methane volume of anaerobic digestion system mL/d

注：同列肩注無相同字母者表示差異顯著(P<0.05)，有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

Note：In the same column, values with the different letter superscripts mean significant difference(P<0.05), same letter superscripts mean insignificant difference(P>0.05).

2.3 SMZ對(duì)厭氧消化中產(chǎn)甲烷菌多樣性的影響

2.3.1 產(chǎn)甲烷菌16SrDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果 分別在試驗(yàn)第0、4、8、28天，采集5個(gè)試驗(yàn)組沼液沼渣混合樣品提取微生物總DNA，并利用產(chǎn)甲烷菌的通用引物進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增所得電泳圖如圖1所示。由圖1可知，所得PCR產(chǎn)物的分子量約為500 bp，片段大小與引物所能擴(kuò)增的產(chǎn)物大小一致，初步鑒定是本試驗(yàn)所需的目的片段。

2.3.2 產(chǎn)甲烷菌多樣性變化的DGGE分析 對(duì)所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析可得圖2。圖2每個(gè)泳道中條帶數(shù)代表產(chǎn)甲烷菌的豐富度，每條帶明暗程度代表其所占比例大小。由圖2可知，在整個(gè)試驗(yàn)過程中，產(chǎn)甲烷菌條帶數(shù)差異較小，但同一位置同種菌群在不同時(shí)期含量不同。

對(duì)DGGE圖譜分析并計(jì)算Shannon's多樣性指數(shù)H＇，從而對(duì)試驗(yàn)開始時(shí)(第0天)、加藥期間(第4天)、加藥期結(jié)束時(shí)(第8天)和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(第28天)的樣品進(jìn)行產(chǎn)甲烷菌多樣性的對(duì)比。SMZ對(duì)厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷菌多樣性指數(shù)H＇的影響如表4所示。第0天和第8天，各組間產(chǎn)甲烷古菌H＇變化無顯著差異(P>0.05)；在第4天和第28天，各試驗(yàn)組的產(chǎn)甲烷菌H＇與CK組無顯著差異(P>0.05)，但加藥期第4天采用直接加入法的B1和B2組H＇顯著高于經(jīng)體內(nèi)代謝法的A1和A2組(P<0.05)；在試驗(yàn)期結(jié)束時(shí)，B1和B2組H＇顯著低于CK組、A1組和A2組(P<0.05)。

選取圖2所示DGGE圖譜中標(biāo)注的1-4條帶進(jìn)行回收測(cè)序，將序列與Genbank進(jìn)行比對(duì)，找到與其相似性最高的菌株，可得結(jié)果如表5所示。結(jié)果表明，試驗(yàn)第4天，B2組出現(xiàn)條帶3(methanobacterium，產(chǎn)甲烷桿菌)，同時(shí)B1和B2組條帶1(uncultureal methnogenic，未培養(yǎng)的產(chǎn)甲烷古菌)較其它試驗(yàn)組亮，說明此時(shí)直接加入法的B1和B2組系統(tǒng)中出現(xiàn)產(chǎn)甲烷桿菌以及未培養(yǎng)的產(chǎn)甲烷古菌數(shù)量增加，這可能解釋了加藥期直接加入組產(chǎn)甲烷菌多樣性指數(shù)H＇和產(chǎn)甲烷量均顯著高于經(jīng)體內(nèi)代謝組的原因。第8天時(shí)，僅在CK組中出現(xiàn)條帶4(methanobrevibacter sp，產(chǎn)甲烷短桿菌)，并且除CK組和A1組外，其余試驗(yàn)組中均未出現(xiàn)條帶1。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，B1和B2組中條帶1和條帶3消失，條帶2(methanosaeta sp，產(chǎn)甲烷鬃毛菌)亮度減弱。而此時(shí)B1和B2組的H＇和產(chǎn)甲烷量均顯著低于經(jīng)體內(nèi)代謝組，這可能是由直接加入組產(chǎn)甲烷桿菌和未培養(yǎng)的產(chǎn)甲烷古菌消失，以及產(chǎn)甲烷鬃毛菌數(shù)量減少造成的。

時(shí)間Time/d04828CK1.42±0.281.65ab±0.061.66±0.191.74b±0.09A11.46±0.361.51a±0.081.72±0.161.72b±0.05B11.47±0.341.72b±0.011.64±0.331.43a±0.21A21.43±0.321.58a±0.051.68±0.151.72b±0.14B21.48±0.171.75b±0.011.71±0.201.40a±0.16

表5 DGGE條帶測(cè)序BLAST比對(duì)結(jié)果Table 5 BLAST results of DGGE band sequences

由圖3可知，試驗(yàn)開始時(shí)，各試驗(yàn)組產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)一致，相似性水平為1。試驗(yàn)第4天時(shí)，B2中產(chǎn)甲烷菌與其它試驗(yàn)組相似性降低。第8天時(shí)，加入SMZ的試驗(yàn)組產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)與CK組相比相似性進(jìn)一步降低。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，A1和A2組中產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)與CK組相似性為1，與B1和B2組相似性為0.86，說明采用兩種研究方法的試驗(yàn)組間產(chǎn)甲烷菌群落出現(xiàn)差異。

3 討 論

3.1 SMZ及N4-ACE-SM2濃度在厭氧消化系統(tǒng)中的變化規(guī)律

SMZ在豬場(chǎng)廢水中降解方式以微生物降解為主，并且在厭氧條件下的降解速率高于好氧試驗(yàn)組[14]。本研究在避光厭氧條件下進(jìn)行，因此微生物降解可能是系統(tǒng)中SMZ濃度降低的主要原因。本研究在試驗(yàn)濃度條件下，兩種研究方法并沒有顯著影響厭氧消化系統(tǒng)中SMZ的累積和降解速度；相同研究方法但加入不同濃度SMZ的試驗(yàn)組間差異也不顯著，其原因可能是豬糞收集試驗(yàn)所收集的豬糞中SMZ的最高濃度和最低濃度差異較小，分別為56.04 mg/kg和47.10 mg/kg，因此不同加入濃度間未表現(xiàn)出顯著差異。

雖然經(jīng)體內(nèi)代謝后含SMZ的豬糞中同時(shí)含有N4-ACE-SM2，而且其含量為其原形濃度的50%左右，但在厭氧消化系統(tǒng)中其濃度卻與直接加入組無顯著差異，說明與直接加入法相比，采用經(jīng)體內(nèi)代謝法時(shí)厭氧消化系統(tǒng)中N4-ACE-SM2的降解速度會(huì)更快。由于經(jīng)體內(nèi)代謝法中含有更多的N4-ACE-SM2，因此可能造成微生物對(duì)于N4-ACE-SM2的降解速度高于直接加入組[15]。研究表明，N4-ACE-SM2在廢水中的降解速度高于在無菌的超純水中，說明微生物對(duì)N4-ACE-SM2的降解起著重要作用[16]。采用經(jīng)體內(nèi)代謝法所用豬糞中同時(shí)含有SMZ和N4-ACE-SM2，但結(jié)果表明，兩種方法下SMZ和N4-ACE-SM2的濃度變化趨勢(shì)相似，且濃度無顯著差異。這可能是由于進(jìn)入到系統(tǒng)中的N4-ACE-SM2并沒有影響其母體的降解速度，同時(shí)經(jīng)體內(nèi)代謝組可能有更多的N4-ACE-SM2，其降解速度也快于直接加入組。此外，高濃度SMZ經(jīng)體內(nèi)代謝的豬糞含有更多的代謝產(chǎn)物，可以增強(qiáng)獸藥對(duì)系統(tǒng)中微生物的抑制作用[15]，從而影響有機(jī)質(zhì)的分解速度和甲烷的產(chǎn)生。

3.2 SMZ對(duì)厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量的影響

若抗生素初始濃度過高，會(huì)對(duì)厭氧消化系統(tǒng)中的微生物產(chǎn)生毒性，抑制微生物活性，造成甲烷產(chǎn)量下降[8,17]。有研究表明，當(dāng)厭氧消化系統(tǒng)中磺胺甲惡唑的濃度在5～1 000 mg/L范圍內(nèi)，隨著磺胺甲惡唑濃度升高，對(duì)累積產(chǎn)甲烷量的抑制率也越高[18]。Loftin等[19]研究也表明，在厭氧消化系統(tǒng)中直接加入不同濃度的SMZ，結(jié)果顯示SMZ會(huì)抑制系統(tǒng)的產(chǎn)甲烷量。本研究表明，在停藥期直接加入法與對(duì)照組和經(jīng)體內(nèi)代謝法相比，抑制了產(chǎn)甲烷量，這與Loftin等[19]研究結(jié)果相似。但在加藥期，直接加入組產(chǎn)甲烷量顯著高于經(jīng)體內(nèi)代謝組，這可能是由于直接加入組在初始時(shí)僅加入了SMZ，而經(jīng)體內(nèi)代謝組同時(shí)含有同濃度的SMZ和一定濃度的代謝產(chǎn)物，二者共同影響厭氧消化系統(tǒng)中微生物的活性，可能造成了該時(shí)期經(jīng)體內(nèi)代謝組產(chǎn)甲烷量受到抑制。而停藥期直接加入組產(chǎn)甲烷量低于經(jīng)體內(nèi)代謝組，其原因可能是進(jìn)入停藥期后，經(jīng)體內(nèi)代謝組厭氧系統(tǒng)中微生物已經(jīng)逐漸適應(yīng)系統(tǒng)環(huán)境，但直接加入組系統(tǒng)中微生物活性仍受到SMZ原形及其代謝產(chǎn)物的抑制[20]，從而使系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量下降。

于宸等[7]采用直接加入法探究SMZ對(duì)豬糞厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)氣量的影響，結(jié)果表明，在系統(tǒng)中添加30，60，120 mg/kg的SMZ，系統(tǒng)中SMZ濃度越高則促進(jìn)越多產(chǎn)酸菌群的生長(zhǎng)，從而合成更多的甲烷形成的前體物質(zhì)，以提高產(chǎn)甲烷量。該結(jié)果與本研究中采用直接加入法的B1組和B2組結(jié)果相似，本研究中B1組和B2組的產(chǎn)甲烷量在加藥期高于停藥期，而系統(tǒng)中SMZ濃度在加藥期也高于停藥期，說明SMZ濃度越高則系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量越高。但在經(jīng)體內(nèi)代謝組則得到不同的結(jié)果，說明飼料中的SMZ經(jīng)體內(nèi)代謝后對(duì)豬糞厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量的影響與直接加入法不同，經(jīng)體內(nèi)代謝法能更準(zhǔn)確評(píng)估豬糞中殘留SMZ對(duì)厭氧消化系統(tǒng)的影響。

3.3 SMZ對(duì)產(chǎn)甲烷菌多樣性的影響

本研究中，在厭氧消化系統(tǒng)中加入SMZ時(shí)，不同的研究方法對(duì)系統(tǒng)產(chǎn)甲烷菌H＇變化有顯著影響。加藥期采用直接加入法的產(chǎn)甲烷菌多樣性顯著高于經(jīng)體內(nèi)代謝法；而停藥期經(jīng)體內(nèi)代謝法的產(chǎn)甲烷菌多樣性顯著高于直接加入法。用直接加入法的產(chǎn)甲烷菌多樣性呈先增加后減少的趨勢(shì)，而用經(jīng)體內(nèi)代謝法的呈持續(xù)增加的趨勢(shì)，且與對(duì)照組趨勢(shì)相似。

有研究表明，采用直接加入法進(jìn)行研究時(shí)，SMZ對(duì)豬糞厭氧消化過程中微生物群落功能多樣性的影響較大。錢金秋[6]發(fā)現(xiàn)，直接加入SMZ抑制了厭氧消化系統(tǒng)的產(chǎn)甲烷量，在試驗(yàn)初期，添加SMZ的試驗(yàn)組與對(duì)照組相比明顯降低了微生物群落的功能多樣性和物種豐富度，這可能是由于抗生素的外來加入抑制了參與發(fā)酵的微生物活性。這與本研究結(jié)果中相似，本研究中，停藥期直接加入組的產(chǎn)甲烷菌多樣性和產(chǎn)甲烷量均受到抑制。

此外，本研究采用經(jīng)體內(nèi)代謝法與空白組的產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)相似度較高，而與直接加入法的相似性降低，因此經(jīng)體內(nèi)代謝法相比直接加入法能更準(zhǔn)確反應(yīng)SMZ殘留對(duì)豬糞厭氧消化系統(tǒng)的影響，結(jié)果更貼近生產(chǎn)實(shí)踐。

4 結(jié) 論

在豬糞厭氧消化系統(tǒng)中，兩種研究方法對(duì)SMZ的累積和降解速度的影響無顯著差異，但采用經(jīng)體內(nèi)代謝法時(shí)N4-ACE-SM2的降解速度更快；加藥期時(shí)采用經(jīng)體內(nèi)代謝法顯著抑制了產(chǎn)甲烷量，而停藥期時(shí)采用直接加入法顯著抑制了產(chǎn)甲烷量；采用經(jīng)體內(nèi)代謝法的產(chǎn)甲烷菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)與空白組具有更高的相似性。因此，采用經(jīng)體內(nèi)代謝法評(píng)估SMZ對(duì)豬糞厭氧消化系統(tǒng)的影響更具合理性，可獲得更準(zhǔn)確的研究結(jié)果。