氨氮急性脅迫對大菱鲆幼魚的毒性效應(yīng)*

孟 振 張鴻麗 劉新富 姜 勇 賈玉東 劉 濱 曲江波 徐榮靜

氨氮急性脅迫對大菱鲆幼魚的毒性效應(yīng)*

孟 振1張鴻麗2劉新富1①姜 勇3賈玉東1劉 濱1曲江波4徐榮靜4

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部極地漁業(yè)開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；2. 暨南大學(xué)赤潮與海洋生物學(xué)研究中心 廣州 510632；3. 青島國家海洋科學(xué)研究中心 青島 266071；4. 煙臺(tái)開發(fā)區(qū)天源水產(chǎn)有限公司 煙臺(tái) 264006)

本研究采用96 h半靜態(tài)毒性實(shí)驗(yàn)方法，研究了氨氮對大菱鲆()幼魚的急性毒性效應(yīng)和血漿生理指標(biāo)的影響。結(jié)果顯示，在水溫為(19.0±0.5)℃、pH為7.85、鹽度為29.5和溶解氧為(7.8±0.2) mg/L的環(huán)境條件下，平均體重為(163.90±15.31) g的大菱鲆幼魚，總氨(TAN)和非離子氨(NH3-N)96 h的半致死濃度(LC50)分別為39.73和0.64 mg/L。氨氮濃度、暴露時(shí)間及二者交互作用對血漿腎上腺素(EPI)、皮質(zhì)醇(Cortisol)、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)、堿性磷酸酶(AKP)和血糖(GLU)含量/活性都存在顯著影響；血漿EPI、SOD、GSH、AKP和GLU隨氨氮濃度升高響應(yīng)時(shí)間提前，EPI、皮質(zhì)醇、AKP和GLU隨暴露時(shí)間延長總體呈現(xiàn)先升后降的趨勢；致死高濃度脅迫(TAN濃度70.96和84.11 mg/L)下，血漿SOD和GSH在脅迫期(12 h)內(nèi)快速升高，GLU快速升高(4 h)后急劇降低(12 h)，暗示氨氮急性致死的原因與氧化應(yīng)激損傷、生理代謝紊亂和呼吸功能受損有關(guān)。本結(jié)果可為大菱鲆大規(guī)格幼魚的養(yǎng)殖管理和行為數(shù)值模擬提供基礎(chǔ)資料。

大菱鲆；氨氮急性脅迫；血漿生理指標(biāo)

氨氮(Ammonia nitrogen, AN)是指水體中以非離子氨(NH3-N)和銨離子(NH4+-N)形式存在的氮，二者可相互轉(zhuǎn)換，受水質(zhì)pH、溫度和鹽度等參數(shù)影響呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)平衡(Johansson, 1980)，統(tǒng)稱為總氨氮(TAN)，對魚類具有很強(qiáng)的毒性(Randall, 2012; Ruyet, 1995)。其中，NH3-N由于親脂性和缺乏電荷，可以較容易地通過鰓上皮細(xì)胞擴(kuò)散，并通過泌氯細(xì)胞主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，造成血液和組織中氨的積累，引發(fā)魚體中毒反應(yīng)，毒性強(qiáng)于NH4+-N(Roumieh, 2013; Weihrauch, 2009)。

大菱鲆()是西班牙、中國和智利等國家的重要海水養(yǎng)殖魚類，中國的年產(chǎn)量達(dá) 5萬多t，約占世界養(yǎng)殖總產(chǎn)量的80%左右(FAO, 2017)。我國大菱鲆養(yǎng)殖的主要方式是利用適溫的地下海水進(jìn)行陸基工廠化流水養(yǎng)殖和循環(huán)水集約化養(yǎng)殖，養(yǎng)殖水體中的氨氮主要來源于飼料等有機(jī)物投入品分解、魚類自身生理代謝和環(huán)境污染等，而在集約化養(yǎng)殖系統(tǒng)中，一旦水交換受到限制或者生物濾池凈化能力不足，系統(tǒng)生物負(fù)載過高，氨氮易出現(xiàn)持續(xù)或瞬間升高，成為魚類生長和生存的限制因素。盡管此前已有對大菱鲆苗種的氨氮半致死劑量、安全濃度(Ruyet, 1995; 曲克明等, 2007)和慢性脅迫(Foss, 2007; Ruyet, 1997)的研究報(bào)道，但未見對養(yǎng)成過程中大規(guī)格幼魚氨氮急性脅迫的生理響應(yīng)研究。此外，氨氮急性脅迫容易引起養(yǎng)殖魚類行為模式的改變，揭示其行為響應(yīng)的生理學(xué)基礎(chǔ)，并用于建立行為數(shù)值模擬的在線預(yù)警系統(tǒng)，可以避免因循環(huán)水系統(tǒng)中氨氮的突然升高導(dǎo)致大菱鲆養(yǎng)殖損失的發(fā)生(Shinoda, 2017; Simon, 2017)。

本研究通過96 h半靜態(tài)急性脅迫實(shí)驗(yàn)，確定大菱鲆大規(guī)格幼魚氨氮的半致死濃度(LC50)和安全濃度(SC)，分析氨氮急性脅迫下血液生理生化指標(biāo)的變化規(guī)律，篩選相應(yīng)的生物標(biāo)志物，揭示機(jī)體行為響應(yīng)的生理基礎(chǔ)，旨在為實(shí)現(xiàn)大菱鲆行為數(shù)值模擬及其在集約化養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)在山東煙臺(tái)開發(fā)區(qū)天源水產(chǎn)有限公司進(jìn)行，幼魚為公司培育的全雌苗種，平均全長為(21.06±0.54) cm、體重為(163.90±15.31) g。選擇體質(zhì)健壯、活力強(qiáng)、規(guī)格整齊的幼魚，實(shí)驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)水槽暫養(yǎng)48 h，暫養(yǎng)期間不投餌。

實(shí)驗(yàn)水槽體積為300 L，實(shí)驗(yàn)用水為紫外線消毒的砂濾海水，水溫為(19.0±0.5)℃，pH為7.85，鹽度為29.5，溶解氧為(7.8±0.2) mg/L，TAN<0.1 mg/L。

1.2 半致死劑量實(shí)驗(yàn)

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得24 h 100%死亡質(zhì)量濃度(LC100, 24 h)和96 h 零死亡質(zhì)量濃度(LC0, 96 h)，設(shè)為上、下限，按等對數(shù)間距設(shè)置氨氮濃度梯度。本實(shí)驗(yàn)中，氨氮質(zhì)量濃度由低到高依次設(shè)置為30.28(A組)、35.90(B組)、42.56(C組)、50.47(D組)、59.82(E組)、70.96(F組)和84.11 mg/L(G組)，共7個(gè)濃度處理組。同時(shí)，設(shè)置對照組(不添加NH4Cl)。氨氮采用分析純NH4Cl(國藥集團(tuán))，以過濾海水配制10 g/L的NH4Cl母液，即配即用。

每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行樣，每個(gè)平行樣放入同規(guī)格大菱鲆幼魚10尾。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，水槽注入300 L新鮮海水，按設(shè)計(jì)濃度加入相應(yīng)體積NH4Cl母液，充氣，靜水培育，每24 h全部換水1次，換水期間，將實(shí)驗(yàn)魚快速轉(zhuǎn)移至新配置的同濃度養(yǎng)殖水槽中。采用納氏試劑法測定養(yǎng)殖水槽0、24 h的實(shí)際氨氮濃度(表1)。實(shí)驗(yàn)期間不投餌，每4 h測量1次水溫、溶解氧和pH，每24 h記錄各平行樣死亡個(gè)體數(shù)量，并及時(shí)剔除死亡個(gè)體，魚體死亡以碰觸15 s內(nèi)無反應(yīng)為準(zhǔn)。

表1 養(yǎng)殖水槽實(shí)時(shí)總氨氮(TAN)濃度

Tab.1 Analyzed TAN and NH3 levels in experimental groups

1.3 氨氮急性脅迫實(shí)驗(yàn)

采用上述氨氮濃度梯度及實(shí)驗(yàn)操作，評估氨氮急性脅迫對大菱鲆大規(guī)格幼魚血液生理、生化指標(biāo)的影響，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行樣，每個(gè)平行樣放入上述同規(guī)格大菱鲆幼魚30尾。

1.3.1 血液樣品采集 在脅迫實(shí)驗(yàn)的0、4、8、12、24、48、72和96 h隨機(jī)取樣采血，每次每組平行樣各隨機(jī)取樣2尾，共6尾魚，其中，F(xiàn)、G組在24 h后，D、E組在72 h后因高死亡率，存活數(shù)量無法滿足要求而不再取樣。采血后，將魚體放入暫養(yǎng)池，不再放回原實(shí)驗(yàn)水槽，以避免對同一條魚重復(fù)取樣。

為減少采血操作對結(jié)果的影響，取樣時(shí)，將魚迅速撈起并立即投入濃度為200 mg/L的MS-222海水中進(jìn)行快速深度麻醉(10~15 s碰觸無反應(yīng))，尾靜脈釆血。采血注射器及離心管均用20 μl的1%肝素鈉溶液浸潤、烘干、冷卻后使用。采集血樣在4℃保溫箱中靜置，以4℃、4000 r/min離心10 min制備血漿，血漿于–80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 血液樣品分析 血漿皮質(zhì)醇(Cortisol)和腎上腺素(EPI)的測定采用上海酶聯(lián)生物研究所的ELISA試劑盒；堿性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)和葡萄糖(GLU)的測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，操作方法參照試劑盒說明書。

1.4 數(shù)據(jù)分析

大菱鲆24、48、72和96 h的TAN和NH3-N的LC50和95%可信區(qū)間使用SPSS 17.0軟件以概率單位加權(quán)回歸(Probit)法求出。SC的計(jì)算公式如下(Sprague, 1971)：

NH3-N濃度由TAN濃度采用《海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(GB 3097-1997)公式換算。

血漿生理生化指標(biāo)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，采用SPSS 17.0軟件雙因素方差分析(Two-way ANOVA)進(jìn)行檢驗(yàn)，并采用Tukey’s多重比較分析同一濃度不同時(shí)間和同一時(shí)間不同濃度處理組間的差異，<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 行為反應(yīng)

大菱鲆大規(guī)格幼魚對氨氮急性脅迫產(chǎn)生明顯的行為反應(yīng)，高濃度組魚體行為響應(yīng)時(shí)間提前，反應(yīng)程度激烈。以G組(TAN為84.11 mg/L)為例，實(shí)驗(yàn)開始1 h內(nèi)，魚體相對安靜伏底，2 h后，陸續(xù)出現(xiàn)部分個(gè)體沿池底快速游動(dòng)，表現(xiàn)出亢奮、煩躁不安的癥狀，受驚后會(huì)急速逃避、快速游動(dòng)、沖擊池壁或沖出水面，短暫、快速運(yùn)動(dòng)后即安靜伏底，逐漸喪失平衡能力，魚體側(cè)翻，反應(yīng)變慢甚至無反應(yīng)。死亡魚體特征表現(xiàn)為身體側(cè)翻、口張大、鰓蓋張開。所有處理組魚體體色均呈變淡的趨勢，高濃度組體色變淡的速度更快，大菱鲆體表特有的色素斑點(diǎn)也因此更加明顯。

2.2 半致死濃度和安全濃度

24 h靜水培育條件下，TAN濃度隨時(shí)間延長呈現(xiàn)一定程度的衰減，損失率介于6.01%(A組)~9.66% (E組)(表1)。本實(shí)驗(yàn)中，24 h換水1次能保證氨氮有效濃度維持在90%以上，因此，以設(shè)計(jì)濃度計(jì)算LC50時(shí)可相對準(zhǔn)確反映大菱鲆對氨氮的耐受程度。氨氮急性脅迫對大菱鲆幼魚的毒性效果見表2。從表2可以看出，隨著氨氮濃度的升高，其毒性作用增加，幼魚死亡率升高；隨著暴露時(shí)間的延長，除最低濃度組外，其他濃度組累計(jì)死亡數(shù)量逐漸增加，氨氮對幼魚的毒性作用隨時(shí)間延長逐漸增加。

SPSS 17.0軟件概率單位加權(quán)回歸(Probit)法分析結(jié)果表明，TAN和NH3-N對大菱鲆24、48、72和96 h的LC50分別為55.71、45.53、41.23、39.73 mg/L和0.89、0.73、0.66、0.64 mg/L，氨氮和NH3-N安全濃度分別為3.97和0.06 mg/L(表3)。

2.3 血液生理和生化指標(biāo)分析

2.3.1 對神經(jīng)內(nèi)分泌激素的影響 氨氮濃度和處理時(shí)間均對大菱鲆血漿EPI含量變化有顯著影響，且二者存在顯著的交互作用(表4)。同一氨氮濃度下，血漿EPI含量隨處理時(shí)間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，處理4 h內(nèi)，各組EPI含量無明顯變化，此后，EPI含量達(dá)到最高值的時(shí)間隨氨氮濃度的升高相應(yīng)提前，高濃度處理組(D、E、F和G組)氨氮脅迫8 h后，EPI含量即達(dá)到最高值，低濃度處理組(A、B和C組)氨氮脅迫24或12 h后，EPI含量達(dá)到最高值。

血漿皮質(zhì)醇含量受氨氮濃度、處理時(shí)間和二者交互作用的顯著影響(表5)。各處理組皮質(zhì)醇含量隨處理時(shí)間延長總體呈現(xiàn)先升后降的趨勢，高濃度組(F和G組)血漿皮質(zhì)醇含量在12 h內(nèi)緩慢升高，12 h顯著高于處理前(<0.05)，除A組外的其余濃度組的皮質(zhì)醇含量在24 h達(dá)最高值，此后，仍維持較高水平，A組血漿皮質(zhì)醇含量在12、72和96 h顯著高于處理前(<0.05)，其他時(shí)間與處理前無明顯差異。

表2 氨氮急性脅迫對大菱鲆幼魚的致死結(jié)果

Tab.2 Lethal results of acute ammonia toxicity on juvenile turbot

表3 氨氮、非離子氨對大菱鲆幼魚的半致死濃度和安全質(zhì)量濃度

Tab.3 The LC50 and SC values of ammonia and non-ion ammonia on juvenile turbot

表4 氨氮急性脅迫對大菱鲆血漿腎上腺素含量的影響

注：—為未檢測；不同小寫字母表示同一濃度組不同時(shí)間存在顯著差異(<0.05)；不同大寫字母表示同一時(shí)間不同濃度組存在顯著差異(<0.05)，下同

Note: — no determination. Different lowercase letters indicate significant differences in the same concentration group at different times (<0.05); Different uppercase letters indicate significant differences in different concentration groups at the same time (<0.05), the same as below

2.3.2 對氧化應(yīng)激參數(shù)的影響 氨氮急性脅迫引起大菱鲆氧化應(yīng)激，啟動(dòng)抗氧化反應(yīng)。各處理組血漿SOD活性受氨氮濃度、處理時(shí)間和二者交互作用的顯著影響(表6)。SOD活性隨氨氮濃度升高響應(yīng)時(shí)間提前，高濃度氨氮脅迫組(F和G組)在脅迫4 h，血漿SOD活性即顯著升高(<0.05)，至12 h時(shí)達(dá)最高值，中間濃度D和E組SOD活性在脅迫8~24 h后也顯著升高(<0.05)，隨后呈下降趨勢，低濃度處理組 (A組~C組)SOD活性則呈下降趨勢，在脅迫后期(72、96 h)顯著低于對照組(<0.05)。

各處理組的血漿GSH含量也受氨氮濃度、處理時(shí)間和二者交互作用的顯著影響(表7)。GSH濃度隨氨氮濃度變化趨勢明顯，高濃度脅迫組(F和G組)血漿GSH含量在脅迫8 h即顯著高于對照組和其他處理組(<0.05)，12 h達(dá)最高值，其他組GSH含量隨氨氮濃度的升高起始上升時(shí)間也相應(yīng)提前，且GSH含量在脅迫處理96 h仍顯著高于對照組(<0.05)。

2.3.3 對免疫機(jī)能的影響 血漿AKP活性受氨氮濃度、處理時(shí)間及交互作用的顯著影響(表8)，各處理組血漿AKP活性隨氨氮濃度的增加起始上升時(shí)間相應(yīng)提前，隨暴露時(shí)間延長總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中，F(xiàn)和G組AKP含量脅迫4~8 h時(shí)顯著升高(<0.05)，低濃度組(A、B、C)則延遲至12~24 h才顯著升高(<0.05)，至72 h達(dá)最高值。

2.3.4 對血液生化指標(biāo)的影響 血漿GLU含量受氨氮濃度、處理時(shí)間及交互作用的顯著影響。各處理組GLU含量隨氨氮脅迫濃度的升高達(dá)到最高值的時(shí)間相應(yīng)提前，而隨處理時(shí)間呈先上升后下降的變化趨勢，高濃度組(F和G組)GLU含量在脅迫4 h即達(dá)最大值，而12 h下降至極低的水平，顯著低于處理前(<0.05)；D和E組GLU含量在8~12 h顯著升高(< 0.05)，至48 h時(shí)迅速下降至極低水平(<0.05)；低濃度組(A、B和C組)血糖8~48 h逐漸升高，72 h后呈下降趨勢，至96 h含量仍顯著高于對照組(<0.05)，但3個(gè)處理組間無顯著差異(>0.05)。

表7 氨氮急性脅迫對大菱鲆血漿谷胱甘肽含量的影響

表8 氨氮急性脅迫對大菱鲆血漿堿性磷酸酶含量的影響

Tab.8 The effect of acute ammonia toxicity on plasma AKP content in turbot

3 討論

氨氮對魚類的毒性效應(yīng)有急性和慢性之分，慢性毒性效應(yīng)常表現(xiàn)為攝食降低、生長減慢、免疫力降低等(Peng, 2017)，而急性效應(yīng)則表現(xiàn)為鰓過度通氣、機(jī)體亢奮、游泳不穩(wěn)定、失去平衡、抽搐或死亡等特征(Ip, 2001; Silva, 2018)。本研究中，氨氮急性脅迫的大菱鲆行為反應(yīng)除表現(xiàn)出上述癥狀外，體色也發(fā)生明顯變化，主要表現(xiàn)在背面體色變淺和體表特有色素斑點(diǎn)變深，而體色的變化在黃顙魚()氨氮脅迫的行為響應(yīng)中也有報(bào)道(李波等, 2009)。因此，在大菱鲆氨氮脅迫行為反應(yīng)數(shù)值模擬分析中，可以將體色和色素斑點(diǎn)作為重要的量化指標(biāo)。

表9 氨氮急性脅迫對菱鲆血糖含量的影響

Tab.9 The effect of acute ammonia toxicity on plasma GLU content in turbot

LC50和SC反映了魚類對氨氮的耐受力，可為養(yǎng)殖管理提供指導(dǎo)(Liao, 2011)。本研究中，大菱鲆幼魚規(guī)格為(163.90±15.31) g，全長為(21.06±0.54) cm，96 h非離子氨LC50為0.64 mg/L(TAN為39.73 mg/L)，低于其稚魚期(體長2.0~2.4 cm)的半致死劑量(1.14 mg/L) (曲克明等, 2007)，Ruyet等(1995)對不同規(guī)格大菱鲆的急性氨氮脅迫實(shí)驗(yàn)也表明，幼魚規(guī)格從(6.3±1.2) g增長至(162.8±44.0) g，非離子氨LC50，96 h從3.41 mg/L下降至1.45 mg/L，此外，規(guī)格為104 g的幼魚長期慢性脅迫的SC為0.1 mg/L(Ruyet, 1997)。上述結(jié)果表明，大菱鲆對氨氮的耐受性隨規(guī)格增加而逐漸降低，多種魚類呈現(xiàn)相似規(guī)律(Randall, 2002)。

已有研究表明，氨氮急性和慢性脅迫可引起大菱鲆血漿促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和皮質(zhì)醇的顯著升高(Ruyet, 1998、2003; 賈睿, 2016)，表明下丘腦–垂體–腎間組織軸(HPI軸)可通過一系列激素的級聯(lián)釋放參與氨氮脅迫的調(diào)節(jié)，以增強(qiáng)機(jī)體抵抗力。本研究中，大菱鲆血漿EPI在氨氮脅迫初期(8~24 h)即顯著升高，此后呈下降趨勢，血漿皮質(zhì)醇的響應(yīng)時(shí)間則較EPI稍延遲，除A組外的低濃度組在24 h達(dá)最高值，此后，略有降低但維持高水平。由此推測，氨氮急性脅迫下，特別是高濃度脅迫可以造成血漿非離子氨濃度的快速升高，引起血紅蛋白氧親和力的急劇降低(Pankhurst, 2011)，交感–嗜鉻組織系統(tǒng)首先被激活，血漿EPI濃度快速升高。HPI軸系統(tǒng)則可能在大菱鲆氨氮脅迫中起主要調(diào)節(jié)作用，表現(xiàn)在血漿皮質(zhì)醇始終維持較高的表達(dá)水平，而EPI在脅迫后期恢復(fù)至對照組水平，這可能與皮質(zhì)醇對EPI的反饋抑制有關(guān)(王美垚, 2009)，大菱鲆神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)對氨氮脅迫的生理響應(yīng)及其調(diào)節(jié)機(jī)理仍有待于從分子水平和激素水平進(jìn)一步探索。

作為關(guān)鍵的氧化應(yīng)激觸發(fā)因素，氨氮誘導(dǎo)水生動(dòng)物產(chǎn)生大量活性氧簇(Reactive oxygen species, ROS)，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激啟動(dòng)抗氧化反應(yīng)(Sun, 2011; Monteiro, 2006; Paulino, 2012)。本研究中，血漿SOD、GSH含量與氨氮濃度和暴露時(shí)間均表現(xiàn)出明顯的響應(yīng)關(guān)系，高致死濃度(F和G組)脅迫4 h，二者即顯著升高，接近死亡高峰時(shí)間(12 h)達(dá)最高值；而低濃度組(A~C組)SOD整體呈現(xiàn)下降趨勢，脅迫后期顯著低于對照組，GSH響應(yīng)時(shí)間延遲至24 h，此后呈先升后降的趨勢，96 h仍顯著高于對照組。本結(jié)果與牙鲆()(葉繼丹等, 2007)、圓斑星鰈()(王貞杰等, 2017)、巴南牙鲆()(Maltez, 2017)、草魚()(周鑫, 2012)和黃顙魚(Zhang, 2018)等多個(gè)物種的氨氮脅迫對魚體氧化應(yīng)激的報(bào)道相似。

氨氮長期脅迫會(huì)造成魚類免疫功能和抗病力降低(黎慶等, 2015)，而急性氨氮脅迫對魚類免疫功能影響的研究相對較少。AKP是魚類重要的非特異性免疫標(biāo)志酶，作為一種細(xì)胞內(nèi)酶，在肝臟、腎臟和血紅細(xì)胞中含量較高，血漿酶水平的變化反映了脅迫造成的組織、細(xì)胞損傷程度和機(jī)體免疫能力(Silva, 2018)。本研究中，血漿AKP酶含量在急性脅迫下隨氨氮濃度的升高響應(yīng)時(shí)間提前，隨處理時(shí)間延長總體呈先升后降的趨勢，和Peyghan等(2002)對鯉魚()的研究結(jié)果相一致。氨氮對魚類最重要的組織病理學(xué)作用是鰓、肝臟、腎臟組織和細(xì)胞的水腫、充血和出血，高濃度氨氮在短時(shí)間內(nèi)即可造成細(xì)胞損傷，胞內(nèi)AKP酶釋放進(jìn)入血漿，使得血漿AKP酶在短時(shí)間快速升高(彭軍輝等, 2018)。低濃度組血漿AKP酶前期緩慢升高與氨氮脅迫引起的機(jī)體免疫應(yīng)激相關(guān)，后期呈下降趨勢則代表機(jī)體免疫力的降低。

魚體應(yīng)激反應(yīng)是一種耗能過程，葡萄糖氧化分解是魚類能量供給的重要途徑，應(yīng)激反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致血糖水平的變化(韓娜娜等, 2010)。氨氮慢性脅迫會(huì)導(dǎo)致魚類血糖濃度的波動(dòng)，血糖會(huì)隨脅迫時(shí)間呈現(xiàn)先升后降的趨勢，高濃度組下降尤其明顯，這一規(guī)律已在鯉魚(王琨, 2007)、南方鯰()(趙海濤, 2006)和阿氏冠鲇()(Silva, 2018)等多種魚類中得到驗(yàn)證。本研究中，GLU含量隨氨氮脅迫濃度升高響應(yīng)時(shí)間提前，而隨時(shí)間呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，高濃度組在脅迫初期(4~8 h)GLU即顯著升高，接近脅迫前的2倍，至死亡前(12、24 h)血糖濃度快速下降。低濃度組脅迫初期(48 h內(nèi))血糖逐漸升高，后期呈下降趨勢，96 h仍顯著高于對照組(<0.05)，相關(guān)結(jié)果與其他魚類氨氮慢性脅迫的血糖變化規(guī)律相似。高濃度組脅迫初期血糖快速升高可能是由于急性脅迫效應(yīng)引起對額外能量的需求，導(dǎo)致糖異生作用加強(qiáng)，血糖含量急速升高(Silva, 2018)，隨著脅迫時(shí)間延長和損傷加劇，機(jī)體應(yīng)對脅迫消耗過多的血糖，血糖急劇下降，血糖代謝紊亂也影響了呼吸代謝的能量供應(yīng)，致使本研究中大菱鲆死亡個(gè)體均呈現(xiàn)缺氧死亡癥狀。

綜上所述，在本實(shí)驗(yàn)條件下，大菱鲆大規(guī)格幼魚[(163.90±15.31) g]TAN和NH3-N 96 h的LC50分別為39.73和0.64 mg/L。氨氮濃度、暴露時(shí)間及二者交互作用對血漿EPI、皮質(zhì)醇、SOD、GSH、AKP和GLU含量/活性都存在顯著影響；其中，血漿EPI、SOD、GSH、AKP和GLU隨氨氮濃度升高響應(yīng)時(shí)間提前，EPI、皮質(zhì)醇、AKP和GLU隨暴露時(shí)間延長總體呈先上升后下降的趨勢；高濃度脅迫組(FG組)血漿SOD和GSH在脅迫期內(nèi)快速升高、GLU快速升高后急劇降低，暗示氨氮急性致死的原因與氧化應(yīng)激損傷、生理代謝紊亂和呼吸功能受損有關(guān)。

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Toxic Effects of Acute Ammonia Stress on Young Turbot

MENG Zhen1, ZHANG Hongli2, LIU Xinfu1①, JIANG Yong3, JIA Yudong1,LIU Bin1, QU Jiangbo4, XU Rongjing4

(1.Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences; Key Laboratory of Sustainable Development of Polar Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao 266071; 2. Research Center for Harmful Algal and Marine Biology of Jinan University, Guangzhou 510632; 3. National Oceanographic Center, Qingdao 266071; 4. Tianyuan Aquaculture Co., Ltd of Yantai Economic Development Zone, Yantai 264006)

Ammonia can easily form in intensive culture systems due to the ammonification of uneaten food and animal excretions, and usually results in detrimental health effects to teleost. The aim of this study was to provide a reference value for the safe regulation and control of ammonia in the aquaculture of turbot,, and obtain the corresponding biomarkers of blood physiological indexes under acute ammonia stress. The acute toxicity effects of ammonia on young turbot [average body weight (163.90±15.31) g] were studied with a 96 h half-static toxicity test. The effects of different ammonia concentrations and exposure times on plasma physiological indexes were determined. The results showed that the semi-lethal concentration (LC50) of total ammonia (TAN) and non-ionic ammonia (NH3-N) for 96 h were 39.73 mg/L and 0.64 mg/L, respectively, when the sea water temperature was (19.0±0.5)℃, pH value 7.85, salinity 29.5, and dissolved oxygen (7.8±0.2) mg/L. The plasma epinephrine (EPI), cortisol (cortisol), superoxide dismutase (SOD), reduced glutathione (GSH), alkaline phosphatase (AKP), and blood glucose (GLU) contents or activities were significantly affected by both the ammonia concentration and exposure time. Furthermore, the interaction between ammonia concentration and exposure time also significantly impacted these indexes. The response time of plasma EPI, SOD, GSH, AKP, and GLU advanced with the increasing of ammonia concentration, while EPI, cortisol, AKP, and GLU showed a trend of increasing first and then decreasing with prolonged exposure. These plasma physiological indexes can be used as biomarkers for acute ammonia toxicity. The plasma physiological responses of the high concentration toxic group were characterized by their plasma SOD and GSH rapidly increasing over the exposure period (within 12 h), and GLU rapidly increased at 4 h and decreased sharply before death. The results suggested that the death of juveniles under acute ammonia toxicity may be due to oxidative stress, physiological metabolic disorders, and impaired respiratory function.

; Acute ammonia toxicity; Plasma physiological indexes

S949

A

2095-9869(2020)02-0051-10

劉新富，研究員，E-mail: liuxf@ysfri.ac.cn

2019-01-15,

2019-03-18

* 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(2016HY-ZD1402)和山東省重大科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目(2018YFJH0703; 2018SDKJ0303)共同資助[This work was supported by the Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS (2016HY-ZD1402),and Major Science and Technology Innovation Projects of Shandong Province (2018YFJH0703; 2018SDKJ0303)]. 孟 振，E-mail: mengzhen@ysfri.ac.cn

10.19663/j.issn2095-9869.20190115003

http://www.yykxjz.cn/

孟振, 張鴻麗, 劉新富, 姜勇, 賈玉東, 劉濱, 曲江波, 徐榮靜. 氨氮急性脅迫對大菱鲆幼魚的毒性效應(yīng). 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2020, 41(2): 51–60

Meng Z, Zhang HL, Liu XF, Jiang Y, Jia YD, Liu B, Qu JB, Xu RJ. Toxic effects of acute ammonia stress on young turbot. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(2): 51–60

LIU Xinfu, Email: liuxf@ysfri.ac.cn

(編輯 陳 輝)