王芳， 馮艷紅， 董家君， 王亞賓， 段志剛

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 450002；2.鄭州市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 鄭州 450007)

腸球菌(Enterococcus)是革蘭氏陽性、兼性厭氧球菌，是人體腸道內(nèi)的常在菌, 也是醫(yī)院內(nèi)的感染主要機會致病菌[1-3]。在腸球菌的感染中，糞腸球菌占據(jù)了80%左右[4]，而屎腸球菌和其他腸球菌僅占20%左右。由于腸球菌具有天然和獲得性抗性能力，對現(xiàn)有的抗生素均產(chǎn)生了耐藥性[5]。如果再考慮到腸球菌對熱和消毒藥物的抗性[6]，這就使得尋求腸球菌治療新的選項和預防變得越來越重要，而發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)表達的重要毒力因子的蛋白就成為免疫治療和免疫預防的重要目標[7]。由于對腸球菌主要毒力因子和分子致病機制研究的有限性，限制了對腸球菌免疫的治療和免疫預防[6]。腸球菌的Cyl、gelE、As、ace、efaA、sprE、esp和性信息素等均已被公認為毒力因子，它們在對宿主細胞吸附、抵抗吞噬細胞殺死、損傷組織細胞等方面發(fā)揮著不同的作用，但由于它們的攜帶率或遺傳結(jié)構(gòu)的多樣性等問題限制了它們的應用。BAKSHI等[8]利用比較基因組學方法評估糞腸球菌菌株的潛在致病性，并確定了一個糞腸球菌毒力島富集模塊。研究表明，糞腸球菌毒力因子編碼的Ebp、Esp、GelE、AS、Ace等均與生物被膜有關(guān)[9]。糞腸球菌 ebp PGCs由4個完整的開放閱讀框組成，編碼Ebp菌毛的因位于染色體中，分布廣泛，保守性高[10]，分別編碼ebpA、ebpB、ebpC菌毛亞單位和srtC分揀酶[11]。EbpA、EbpB、EbpC作為糞腸球菌菌毛相關(guān)操縱子，與其菌毛的形成、黏附侵入機體和生物被膜的形成有關(guān)[12]。細菌菌毛在黏附定植宿主上皮細胞，在引發(fā)機體感染等過程中發(fā)揮著重要的作用，并且菌毛蛋白作為一種細菌表面蛋白結(jié)構(gòu)具有較好的免疫原性，能夠刺激機體產(chǎn)生相對應的特異性抗體[10,13-14]。對臨床分離菌株菌毛的研究發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌Ebp菌毛蛋白能介導對膠原蛋白、纖維蛋白原和血小板的黏附，進而引起心內(nèi)膜炎，且在生物膜的形成過程中也扮演著重要作用[15]。因此，Ebp菌毛蛋白有望成為一個良好的免疫原。

糞腸球菌主要通過黏附、侵襲和細胞損傷導致感染發(fā)生。其中，黏附是感染的關(guān)鍵一步，而且, 糞腸球菌在感染的過程中可以形成生物被膜，生物被膜給糞腸球菌提供了生長與繁殖的天然的屏障與保護作用，并能增強其致病性[16]。作者在前期研究中，對豬源糞腸球菌Ebp菌毛進行了克隆和序列分析，發(fā)現(xiàn)EbpA、EbpB和EbpC有6個與免疫相關(guān)的抗原表位，將這6個抗原表位分別進行克隆、表達、純化和免疫新西蘭大白兔后，初步驗證了這6個Ebp菌毛抗原亞單位蛋白的免疫源性。為了進一步驗證Ebp菌毛亞單位片段的對糞腸球菌的免疫保護作用，將這6個Ebp菌毛亞單位多抗血清和純化的IgG分別進行糞腸球菌生物膜形成、黏附侵入阻斷試驗，以篩選出對糞腸球菌致病作用有明顯影響的菌毛亞單位蛋白片段，從而為糞腸球菌的治療和免疫預防以及感染診斷奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、細胞、試驗動物與菌毛蛋白多克隆抗血清

糞腸球菌N9和N41菌株(分離自河南地區(qū)送檢病死豬內(nèi)臟，并經(jīng)Vitek-32全自動細菌鑒定系統(tǒng)及16S rRNA測序鑒定到種水平的菌株，-80 ℃下保存在50%甘油中)、豬腸道上皮細胞(IPEC-J2)均為河南省動物性食品安全重點實驗室保存。動物源性糞腸球菌Ebp菌毛蛋白多克隆抗血清為河南省動物性食品安全重點實驗室原核表達菌毛蛋白EbpA片段(EbpA1、EbpA2和EbpA3)、EbpB片段(EF1092A)、EbpC片段(EbpC1、EbpC2)、免疫清潔級新西蘭大白兔制備，經(jīng)雙向瓊脂擴散試驗檢測蛋白EbpA1、EbpA2、EbpA3、 EF1092A、EbpC1和EbpC2的抗血清效價分別高達1∶16、1∶8、1∶32、1∶64、1∶32和1∶64，通過Western Blot檢測多抗血清具有很好的特異性，收集的血清加入防腐劑分裝后-80 ℃保存。

1.2 多克隆抗體血清的純化

將多克隆抗血清用飽和硫酸銨鹽析方法粗提取的IgG，加入到經(jīng)預處理的DEAE-52纖維素層析柱中，然后用洗脫液(pH=6.4的0.017 5 mol·L-1PBS)進行洗脫并收集。用以ND-1000型微量紫外分光光度計測定其含量，-80 ℃保存。

1.3 生物被膜形成和阻斷試驗

生物被膜形成試驗參照文獻[17]略有改進。將保存的菌株在BHI液體培養(yǎng)基培養(yǎng)并調(diào)整菌液濃度為1. 5×108CFU·mL-1。用TSB+0.25%葡萄糖培養(yǎng)基將菌液稀釋100倍后加入到96孔聚苯乙烯板中，100 μL·孔-1，5株·孔-1，在36 h時用PBS緩沖液洗板3次，晾干并用甲醇固定。用1%結(jié)晶紫染色定量生物膜的產(chǎn)生并用分光光度計(570 nm)測定其吸光度。而對生物被膜阻斷試驗基本同生物被膜形成試驗，僅在加入TSB+0.25%葡萄糖培養(yǎng)的菌株同時，加入優(yōu)化的100 μL·孔-1的多抗血清或IgG充分混勻，余下同生物被膜形成試驗。并用含有TSB+0.25%葡萄糖培養(yǎng)基作為空白對照試驗。

1.4 兔多抗對細胞黏附、侵襲的影響

1.4.1 菌株、細胞的培養(yǎng) 將N9、N41菌種劃線于BHI瓊脂平板上，37 ℃溫箱培養(yǎng)24～48 h。挑取單個菌落接種于BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600 nm值為0.8。黏附、侵襲試驗前，將細菌培養(yǎng)至對數(shù)中期，8 000 r·min-1離心5 min，PBS液洗3次，用無血清無雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋細菌至1×108CFU·mL-1備用。使用IPEC-J2細胞生長至單層細胞時用于細菌的黏附與侵襲的培養(yǎng)。

1.4.2 細菌的黏附、侵襲細胞試驗 細菌的黏附、侵襲試驗按文獻[18-19]的方法稍加改動。待生長至單層的細胞加入108cfu·mL-1菌懸液100 μL(MOI：100∶1)，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h后，棄培養(yǎng)基，D-HanK’s液洗滌3次，隨后進行黏附、侵襲試驗。在黏附試驗中，用1%的Triton X-100溶解細胞，室溫靜置10 min，并用PBS混勻制成懸液做10倍倍比稀釋，接種到BHI瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后，計算同一稀釋度平板的平均CFU值。在進行侵襲試驗時，每孔加入含慶大霉素 (100 mg· L-1)和萬古霉素(10 mg·L-1)的RPMI-1640培養(yǎng)液1 mL，繼續(xù)孵育1.5 h，再用D-HanK’s液洗5次，隨后的侵襲率計算同黏附試驗。

1.4.3 多抗血清和IgG對細胞黏附和侵襲的影響 多抗血清和IgG對細胞黏附和侵襲的影響基本同細菌的黏附、侵襲試驗。按不同濃度加入多抗血清和IgG進行優(yōu)化，然后用優(yōu)化的等體積的多抗血清和IgG與細菌菌株在37 ℃下孵育1 h，將細菌與血清或IgG混合液接種于24孔細胞板，其他條件和操作同1.4.2細菌的黏附和侵襲細胞試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 多克隆抗體純化結(jié)果

粗提取并純化的兔多克隆抗體EbpA1、EbpA2、EbpA3、EF1092A、EbpC1、EbpC2和陰性，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定純化后的IgG見圖1。從圖1可以看出，純化后的IgG有明顯的2條帶，這是因為β-巰基乙醇可以還原免疫球蛋白重鏈與輕鏈間的二硫鍵，從而使兩者分離開；其中，,1條約50 kD為IgG的重鏈，另1條為輕鏈，約25 kD，且輕鏈一般比較彌散。

M：蛋白質(zhì)分子量標準；1～7分別表示兔抗EbpA1，EbpA2，EbpA3，EF1092A，EbpC1，EbpC2，陰性多克隆抗體IgG純化結(jié)果。M: protein molecular weight standard; 1 to 7 indicate rabbit anti-EbpA1, EbpA2, EbpA3, EF1092A, EbpC1, EbpC2, negative polyclonal antibody IgG purification results. A：粗提取的IgG條帶。B：純化后的IgG條帶。A:Crude extracted IgG band. B:Purified IgG band.圖1 粗提、純化IgG SDS-PAGE鑒定Fig.1 The SDS-PAGE identification of purificated IgG

2.2 多抗血清及IgG對糞腸球菌生物被膜形成的影響比較

糞腸球菌菌毛亞單位蛋白EbpA1、EbpA2、EbpA3、EF1092A、EbpC1和EbpC2多抗血清的不同效價均對糞腸球菌的生物被膜形成有阻斷作用，其最佳效價分別為：1∶8、1∶8、1∶16、1∶64、1∶16和1∶64。以最佳效價菌毛亞單位蛋白多抗血清與糞腸球菌N41和N9菌株作用后對其生物被膜形成的影響如表1所示。菌毛蛋白多抗血清EbpA1和EbpC1對N9菌株生物被膜的形成有阻斷作用，但僅有EbpA1與陰性對照相比差異顯著(P<0.05)。而對于N41菌株EbpA1，EbpA2，EbpA3，EF1092A，EbpC1和EbpC2對N41菌株生物被膜的形成均有阻斷作用，但僅有多抗血清EbpA1與空白對照相比有顯著的阻斷作用(P<0.05)。

表1 ebp菌毛蛋白多抗血清對糞腸球菌生物被膜形成的影響Table 1 The influence of ebp pili protein antiserum on E.faecalis biofilm formation

注：a代表與陰性對照組相比差異顯著；b代表與空白對照相比差異顯著。

Note: a represents a significant difference compared to the negative control group; b represents a significant difference compared to the blank control.

糞腸球菌菌毛亞單位蛋白EbpA1、EbpA2、EbpA3、EF1092A、EbpC1、EbpC2多抗IgG濃度不同對N9、N41菌株生物被膜形成的影響有差異。其中，僅有多抗IgG EbpA1、EbpA3和EbpC1對糞腸球菌生物被膜的形成有阻斷作用。EbpA1和EbpC1菌毛亞單位蛋白多抗IgG均在質(zhì)量濃度為0.375 mg·mL-1時對細菌生物被膜形成的阻斷作用最強，而EbpA3菌毛蛋白多抗IgG在質(zhì)量濃度為0.75 mg·mL-1時對細菌生物被膜形成的阻斷作用最強，如表2所示。除了EbpA3和EbpC1對N9菌株生物被膜形成與陰性對照相比有顯著差異外(P<0.05)，EbpA1對N9、N41菌株和EbpA3、EbpC1對N41菌株生物被膜形成與陰性和空白對照相比均有顯著阻斷作用(P<0.05)。

表2 不同質(zhì)量濃度菌毛蛋白多抗IgG對糞腸球菌生物被膜形成的影響

注：a代表與陰性對照組相比差異顯著；b代表與空白對照相比差異顯著。

Note: a represents a significant difference compared to the negative control group; b represents a significant difference compared to the blank control.

2.3 兔多抗對細菌黏附、侵襲細胞的影響

2.3.1 最佳多抗血清效價及純化IgG的濃度優(yōu)化 通過細菌黏附阻斷預試驗發(fā)現(xiàn)EbpA1、EbpA2、EbpA3、EF1092A、EbpC1和EbpC2多抗血清阻斷細菌黏附細胞的最佳血清效價分別是1∶8、1∶8、1∶16、1∶8、1∶32、1∶64；IgG最佳質(zhì)量濃度分別為0.75、0.75、1.5、0.75、0.75、1.5 mg·mL-1。

2.3.2 Ebp菌毛蛋白多克隆血清對細菌黏附、侵襲細胞的影響 多抗血清以最佳效價與細菌作用1 h，其混合物黏附細胞1.5 h后，細菌黏附細胞的結(jié)果如圖2。6個多抗血清都對N9、 N41菌株黏附細胞有阻斷作用，但EbpA1和EbpC1對N9、N41菌株的黏附阻斷作用最強(P<0.05)；EbpA3和EbpC2雖對N9菌株黏附有明顯的阻斷作用，但在對N41的黏附阻斷作用中，僅與空白對照相比有顯著差異(P<0.05)。另外，在多抗血清作用下，N41菌株的黏附率更低，但在陰性血清對照中，兩菌株則出現(xiàn)了明顯的差異，N9菌株陰性對照黏附作用更強，而N41菌株則較低，甚至低于EF1092A。

多抗血清對細菌侵襲細胞阻斷程度基本同黏附的阻斷程度，結(jié)果如圖3。6個多抗血清對N9、N41菌株侵襲細胞均具有一定的阻斷作用，但EbpA1和EbpC1對N9、N41菌株的侵襲阻斷作用更強，且與陰性對照和空白對照相比差異極顯著(P<0.01)；其他各多抗血清也具有明顯的侵襲阻斷作用(P<0.05，N41菌株的陰性對照除外)。從兩菌株的侵襲率分析，N41菌株較N9菌株更低；但在陰性對照中，同樣出現(xiàn)了黏附阻斷作用現(xiàn)象，即N9菌株的陰性對照侵襲率最高，而N41菌株則低于EF1092A。

圖2 菌毛蛋白多抗血清對細菌黏附IPEC-J2細胞的影響Fig.2 The pili protein polyclonal antisera effects on bacterial adhesion IPEC-J2 cells

圖3 菌毛蛋白多抗血清對細菌侵襲IPEC-J2細胞的影響Fig.3 The pili protein polyclonal antisera effects on bacterial invasion IPEC-J2 cells

圖4 菌毛蛋白多抗IgG對細菌黏附IPEC-J2細胞的影響Fig.4 The pili protein t polyclonal IgG effects on bacterial adhesion IPEC-J2 cells

圖5 菌毛蛋白多抗IgG對細菌侵襲IPEC-J2細胞的影響Fig.5 The pili protein t polyclonal IgG effects on bacterial invasion IPEC-J2 cells

2.3.3 Ebp菌毛蛋白多克隆IgG對細菌黏附、侵襲細胞的影響 多抗IgG以最佳濃度與細菌作用1 h，其混合物黏附細胞1.5 h后，細菌黏附細胞的結(jié)果如圖4。由圖4可見，EbpA1和EbpC1多抗IgG對N41菌株和N9菌株均具有黏附阻斷作用，但對N41菌株(P<0.01)明顯強于N9菌株(P<0.05)有黏附阻斷作用；其余4種多抗IgG則作用不同， EbpA2、EbpA3、EF1092A和EbpC2對N9菌株與陰性對照相比有一定的阻斷作用，但與空白對照相比，尤其是EbpA2卻具有促進黏附作用(P<0.01)；EbpA3、EF1092A對N41菌株具有明顯的阻斷作用，而EbpA2、EbpC2則具有促進黏附作用。

多抗IgG對細菌侵襲細胞作用基本同黏附作用，結(jié)果如圖5所示。多抗IgG EbpA1、EbpC1的侵襲阻斷作用對N41菌株(P<0.01)強于對N9菌株(P<0.05)；多抗IgG EbpA3、EF1092A和EbpC2對N9菌株與陰性相比有一定的阻斷作用，而多抗IgG EbpA3、EF1092A對N41菌株則有一定的抑制侵襲作用(P<0.05)。

3 討論

Ebp菌毛是糞腸球菌的表面菌毛，在腸球菌中尤其在糞腸球菌和臨床菌株中廣泛分布且具有較好的保守性[7],同時也在人的心內(nèi)膜炎、尿道感染和生物膜形成中發(fā)揮重要作用并具有良好的免疫原性[10,13-15]。在糞腸球菌中還發(fā)現(xiàn)了能夠介導血小板、膠原和纖維蛋白原的黏附，從而引起心內(nèi)膜炎的ebp菌毛相關(guān)毒力基因，這些基因可以編碼菌毛蛋白，調(diào)節(jié)菌毛生物作用[20]。研究證明，ebp菌毛基因缺失突變株對血小板、膠原和纖維蛋白原的黏附能力均顯著降低[10]。因此，進一步研究動物感染中Ebp菌毛的致病作用和免疫原性，將可以為腸球菌尤其是糞腸球菌免疫預防、治療以及診斷奠定堅實的基礎(chǔ)。由于Ebp菌毛蛋白分別由EbpA(1033aa)、EbpB(476aa)和EbpC(625aa)3個較大的蛋白組成[21]，故尋求它們的抗原表位建立亞單位蛋白抗原，可以更加有效地研究其致病性和免疫保護作用。

本研究使用6個Ebp菌毛亞單位蛋白抗體來研究動物源糞腸球菌Ebp菌毛蛋白的致病性，僅有EbpA1和EbpC1在細菌的生物膜形成和豬腸上皮細胞IPEC-J2的黏附及侵入具有明顯的阻斷作用，這一結(jié)果與NALLAPAREDDY等[10]和PINKSTON等[22]報道的結(jié)果相一致。這不但表明構(gòu)建的EbpA1和EbpC1的正確性，也說明Ebp菌毛蛋白在人源和豬源的致病作用和可能的免疫治療作用。

本研究使用糞腸球菌N9和N41兩株菌株在體外進行Ebp亞單位蛋白的致病性研究，主要是為了驗證Ebp亞單位蛋白抗體在不同的糞腸球菌中作用。由于N9和N41菌株在主要的表面黏附毒力因子的不同(因為N9菌株缺少ace毒力基因)，也可以檢驗不同毒力因子對其黏附的貢獻。試驗結(jié)果表明，EbpA1和EbpC1對N41和N9菌株的黏附均具有阻斷作用，但對N41的阻斷能力強于N9菌株。Ebp和Ace均為細菌表面主要黏附素，N9菌株由于缺少ace基因，EbpA1和EbpC1應該對N9菌株的黏附阻斷作用強于N41菌株，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是Ace的受體宿主細胞外基質(zhì)蛋白在完整的上皮細胞不易暴露，從而不能被Ace識別；另一種可能是Ebp表達效率，由于Ebp表達需要雙穩(wěn)定表達模式，不同的糞腸球菌Ebp表達范圍在30%～72%之間[23]。