乳酸菌發(fā)酵香菇柄產(chǎn)γ-氨基丁酸培養(yǎng)基的優(yōu)化

劉麗娜，王安建，李順峰，田廣瑞，魏書信，高帥平

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州 450002）

香菇（Lentinus edodes）是我國特產(chǎn)食用菌，不僅味道鮮美、營養(yǎng)豐富，而且具有獨特的香氣，深受人們的喜愛[1]。2016年，我國香菇產(chǎn)量達898萬t，居我國六大主要食用菌品種之首。香菇柄是香菇商品化處理的廢棄物，占整個子實體質(zhì)量的15%～30%。由于菇柄呈纖維化，適口性差，少量用作飼料，絕大部分都被廢棄，全國每年廢棄的香菇柄有數(shù)萬噸，造成了極大的資源浪費。實際上香菇柄和菇蓋同樣是由香菇菌絲組成，含有豐富的蛋白質(zhì)、糖類、維生素、礦物元素、膳食纖維等營養(yǎng)成分，其中谷氨酸在其蛋白質(zhì)組成和游離氨基酸中均是含量最高的[2]，而谷氨酸在谷氨酸脫羧酶（Glutamic acid decarboxylase，GAD）脫羧作用下可生成γ-氨基丁酸（GABA），它是一種功能性氨基酸。因此，香菇柄可作為開發(fā)功能食品的潛在基料。

在γ-氨基丁酸的食品開發(fā)中，采用生物技術(shù)方法獲得的GABA制品具有廣闊前景。除了傳統(tǒng)的茶和米胚芽類制品外，米糠[3]、糙米[4]、乳制品類[5-6]等也被研究通過生物技術(shù)強化GABA含量，進而提高其附加值。目前已在大腸桿菌、乳酸菌、酵母菌、曲霉等微生物中發(fā)現(xiàn)谷氨酸脫羧酶的存在，其中用乳酸菌生產(chǎn)GABA是被公認(rèn)為安全、綠色天然的方法。很多乳酸菌都具有產(chǎn)GABA的能力，但在GABA生產(chǎn)上研究最多的乳酸菌是短乳桿菌、乳酸乳球菌、類干酪乳桿菌等[7]。

培養(yǎng)基優(yōu)化是提高發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量的有效途徑之一，培養(yǎng)基成分會影響乳酸菌合成GABA[8]。周青等[9]優(yōu)化了Lactobacillus plantarumWZ011的發(fā)酵培養(yǎng)基，GABA產(chǎn)量達到5.814 g/L，比優(yōu)化前提高了79%。孟和畢力格等[10]對Lactobacillus lacticWH11-1的發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基，發(fā)酵液中GABA含量達到了10.78 g/L。Park等[11]利用Lactobacillus brevisOPY-1發(fā)酵脫脂牛乳產(chǎn)GABA時，向培養(yǎng)基中添加大豆提取物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GABA產(chǎn)量從1.5 μg/g提高到424.67 μg/g?；谖墨I報道與分析，本研究從拓展香菇柄廢棄物深加工綜合利用的角度出發(fā)，采用低成本的香菇柄為培養(yǎng)基料，利用乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)GABA，以期為新型富含GABA的功能性香菇制品的開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

香菇柄原料，購自農(nóng)貿(mào)市場，烘干后粉碎過40目篩，取篩下物密封保存?zhèn)溆谩?/p>

植物乳桿菌植物亞種（Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum，GIM1.380），購自廣東省微生物菌種保藏中心；MRS肉湯培養(yǎng)基，購自廣東省環(huán)凱生物科技有限公司；GABA標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈、乙酸鈉、冰醋酸、氯甲酰芴甲酯（FMOC-Cl）均為色譜純；四氫呋喃、谷氨酸、硼酸、硼砂、谷氨酸鈉、乙醇、重蒸酚、次氯酸鈉、葡萄糖、磷酸吡哆醛（PLP）、氯化鈣等均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

FA2004C型分析天平，THZ-98AB型恒溫振蕩器，XM120-HR型快速水分測定儀，MJ-78A型高壓滅菌鍋，VS-840K-U型超凈工作臺，DF-10型恒溫磁力攪拌器，GZX-9240MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱，UV-1800型紫外可見分光光度計，LD-Y300A型高速萬能粉碎機，Advanced-I型艾柯超純水機，F(xiàn)E20型pH計，H2050R型臺式高速冷凍離心機，Dionex Ultimate 3000型高效液相色譜儀。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵劑的制備

將植物乳桿菌植物亞種GIM1.380菌種接種在滅過菌的MRS肉湯培養(yǎng)基中，接種量2%，培養(yǎng)溫度為37℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)16~20 h為活化一次，共活化培養(yǎng)3次，即得到發(fā)酵劑[12]。

1.2.2 乳酸菌發(fā)酵香菇柄產(chǎn)GABA發(fā)酵試驗

將香菇柄粉與去離子水按料液比1∶20（g/mL）混勻后作為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌冷卻至室溫，接入4%發(fā)酵劑，發(fā)酵溫度37℃條件下，150 r/min振蕩培養(yǎng)發(fā)酵60 h，發(fā)酵結(jié)束后測定生成GABA的產(chǎn)量[13]。

1.2.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基成分的確定

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（香菇柄粉與去離子水按料液比1∶20(g/mL)混勻）中分別加入不同含量谷氨酸鈉（2、4、6、8、10、12 g/L）、不同含量氯化鈣（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L）、不同含量 PLP（0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 g/L），研究其對GABA產(chǎn)量的影響。

1.2.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基組成的優(yōu)化

選擇谷氨酸鈉、氯化鈣、PLP三個因素，在單因素試驗基礎(chǔ)上進行L9(34)正交試驗，以GABA產(chǎn)量為評價指標(biāo)，確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)組成。正交試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment單位：g/L

1.2.3 HPLC法測定GABA

1.2.3.1 色譜條件[14]

ZORBAXEclipsePlusC18色譜柱（4.6mm×250mm，5 μm）；流速 1 mL/min；柱溫度：40 ℃；進樣體積：20 μL；采用二極管陣列紫外檢測器PDA-3000，檢測波長：265 nm；流動相：A為50 mmol/L乙酸鈉溶液（pH 4.8）-甲醇-乙腈-四氫呋喃（82∶8.5∶8.5∶1，V/V），B為50 mmol/L乙酸鈉溶液（pH 4.8）-甲醇-乙腈-四氫呋喃（22∶38.5∶38.5∶1，V/V），A-B 為體積比 30∶70 等度洗脫。

1.2.3.2 衍生程序

取80 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品于1.5 mL離心管中，依次加入 180 μL 超純水、160 μL 0.1mol/L 硼酸-硼砂緩沖液（pH 8.6）、240 μL 乙腈和 160 μL 4mmol/L FMOC-Cl溶液，混合均勻，在40℃水浴鍋中反應(yīng)5 min，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后備用。其中衍生試劑4 mmol/L FMOC-Cl溶液配制方法為：稱量0.026 g FMOC-Cl溶于25 mL乙腈中。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理采用Origin 8.6和SPSS 22.0軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC測定香菇柄發(fā)酵液中GABA的分析

以FMOC-Cl為柱前衍生劑，采用高效液相色譜法對發(fā)酵液中的GABA進行檢測。圖1~3分別表示標(biāo)準(zhǔn)品、衍生劑、香菇柄發(fā)酵液色譜圖。通過對比可以看出，GABA與衍生劑色譜圖峰形好，得到了很好地分離，GABA出峰的保留時間是5.93 min左右，香菇柄發(fā)酵液中其他氨基酸或干擾物對GABA的測定均無影響，說明本法檢測GABA能夠滿足試驗分析要求。取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，衍生后測定GABA，以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得到回歸方程為：Y=0.380 5X+0.414 5（R2=0.999 4），GABA濃度在10~1 000 mg/L時線性關(guān)系良好，能用于發(fā)酵液中GABA的定量分析。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基成分的確定

2.2.1 谷氨酸鈉添加量對發(fā)酵液GABA產(chǎn)量的影響

在發(fā)酵過程中，谷氨酸鈉是谷氨酸脫羧酶催化酶促反應(yīng)生成GABA的底物，發(fā)酵時谷氨酸鈉的添加量會直接影響GABA的產(chǎn)量[15]。如圖4所示，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加谷氨酸鈉能顯著提高GABA產(chǎn)量（P＜0.05），隨著谷氨酸鈉添加量的增加，GABA產(chǎn)量逐漸增大，當(dāng)谷氨酸鈉添加量達到8 g/L時，GABA產(chǎn)量達到最大，之后繼續(xù)增加谷氨酸鈉添加量，GABA產(chǎn)量反而減小。說明試驗菌種利用底物谷氨酸鈉進行生物轉(zhuǎn)化GABA的能力是有限的，過量添加反而不利于GABA的積累，這可能是因為底物濃度過高會增強細胞膜的滲透壓力，抑制菌體生長，從而導(dǎo)致GABA產(chǎn)量減少[16]。

2.2.2 氯化鈣添加量對發(fā)酵液GABA產(chǎn)量的影響

谷氨酸脫羧酶是生物技術(shù)富集生產(chǎn)GABA的關(guān)鍵酶，有許多資料報道鈣離子對谷氨酸脫羧酶有促進作用[17-19]。本試驗在其他發(fā)酵條件一致的情況下，向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加了不同含量的氯化鈣。試驗發(fā)現(xiàn)（圖5）：當(dāng)氯化鈣添加量低于0.2 g/L時，發(fā)酵液中GABA產(chǎn)量逐漸增加；氯化鈣添加量為0.2 g/L時，GABA產(chǎn)量最高，與添加量為0.3 g/L之間無顯著性差異；繼續(xù)提高添加量，GABA產(chǎn)量顯著降低（P＜0.05）。這說明一定范圍內(nèi)添加氯化鈣能明顯提高發(fā)酵液中GABA產(chǎn)量，添加量過高時會因抑制谷氨酸脫羧酶的活性反而使GABA產(chǎn)量降低，這與同仲彬等[20]和Guo等[21]的研究結(jié)果一致。

2.2.3 PLP添加量對發(fā)酵液GABA產(chǎn)量的影響

PLP是多種脫羧酶的輔酶，能增強脫羧酶活性，促進酶促反應(yīng)，其添加量會直接影響谷氨酸脫羧酶的活性，進而影響GABA產(chǎn)量[22-23]。由圖6可知，培養(yǎng)基中添加PLP后，發(fā)酵液中GABA產(chǎn)量呈現(xiàn)先升高再降低后趨于平緩的趨勢；PLP添加量小于0.2 g/L時，GABA產(chǎn)量隨PLP的增加而顯著增加（P＜0.05），添加量達到0.2 g/L時，GABA產(chǎn)量最高，為130.50 mg/L。說明PLP對試驗菌種的谷氨酸脫羧酶具有一定的促進作用，谷氨酸脫羧酶活性增強，利于GABA的生成。同時，由于PLP也是GABA-轉(zhuǎn)氨酶的輔酶，當(dāng)其濃度足夠高時，就會促進催化GABA降解成琥珀酸半醛，使GABA產(chǎn)量降低[24-25]。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基組成的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對谷氨酸鈉、氯化鈣、PLP添加量進行四因素三水平正交試驗，試驗結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

根據(jù)表2的結(jié)果，經(jīng)極差分析可知，3個因素對GABA產(chǎn)量的影響從大到小的順序為：A＞C＞B，即谷氨酸鈉添加量影響最大，其次是PLP添加量，氯化鈣添加量的影響最小。發(fā)酵培養(yǎng)基組成的最優(yōu)組合為A2B3C2，即谷氨酸鈉添加量為8 g/L，氯化鈣添加量為0.3 g/L，PLP添加量為0.2 g/L。經(jīng)驗證試驗得出，該最優(yōu)組合的GABA產(chǎn)量為190.93 mg/L。由表3方差分析可知，谷氨酸鈉添加量（A）和PLP添加量（C）對GABA產(chǎn)量影響顯著（P＜0.05），而氯化鈣添加量（B）對GABA產(chǎn)量的影響相對較小。

2.4 香菇柄發(fā)酵前后GABA含量的比較

香菇柄發(fā)酵前后GABA含量的HPLC分析結(jié)果見圖7。

對比香菇柄發(fā)酵前后GABA含量的離子色譜圖，根據(jù)面積歸一化法計算出發(fā)酵前后GABA的含量，結(jié)果見表4。經(jīng)過發(fā)酵后，發(fā)酵液中GABA產(chǎn)量由31.82 mg/L提高至190.93 mg/L，未經(jīng)過發(fā)酵處理的香菇柄中GABA含量是0.493 mg/g菇粉，采用優(yōu)化后發(fā)酵工藝進行發(fā)酵后的香菇柄中GABA含量增加到2.959 mg/g菇粉，比香菇柄原料提高了5倍，說明利用乳酸菌發(fā)酵香菇柄可以富集GABA。

表4 香菇柄發(fā)酵前后GABA含量的比較Table 4 Comparison of GABA content in Lentinus edodes stem before or after fermentation

3 結(jié)論

本研究采用FMOC-Cl衍生HPLC法定量分析GABA，通過單因素試驗和正交試驗對乳酸菌發(fā)酵香菇柄的培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化，確定了最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：谷氨酸鈉添加量8 g/L，氯化鈣添加量0.3 g/L，PLP添加量0.2 g/L。在此條件下，發(fā)酵液中GABA產(chǎn)量可達190.93 mg/L，發(fā)酵香菇柄中GABA含量達到2.959 mg/g菇粉，比未經(jīng)發(fā)酵處理的香菇柄原料提高了5倍。發(fā)酵菌種、發(fā)酵原料對GABA含量具有很大的影響。本文研究結(jié)果表明，基于乳酸菌進行富含GABA和乳酸菌功能性香菇柄食品的研究和開發(fā)是可行的，是拓展香菇柄的精深加工、增強其功能性的一條新途徑，但試驗菌種產(chǎn)GABA的代謝途徑及發(fā)酵后香菇柄的抗菌功能還有待于進一步的研究。