葉健明，石寧蕙，楊群慧，蘇麗明，周建中，楊海燕

（新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052）

鷹嘴豆（Cicer arietinumL.）是世界第二大消費豆類，產(chǎn)量居世界豆類第三，是目前世界上栽培面積較廣的食用豆類作物之一[1]。目前，中國對鷹嘴豆的食用主要以干制和鮮食為主，對鷹嘴豆蛋白的利用較少。蛋白質(zhì)是核心營養(yǎng)素之一，可提供能量和氨基酸[2]，因而氨基酸的組成、含量及其消化吸收后的生物利用率是營養(yǎng)質(zhì)量評價的重要性指標[3]。鷹嘴豆富含人體所需的18種氨基酸[4]，8種必需氨基酸種類齊全、組成均衡，是一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白源[5]。Newman等[6]研究發(fā)現(xiàn)，鷹嘴豆蛋白的蛋白功效比值（PER）在2.8左右，消化率為79%~88%，對比試驗表明鷹嘴豆蛋白質(zhì)量與大豆蛋白相似。進一步開發(fā)、利用鷹嘴豆蛋白資源是解決蛋白質(zhì)不足的辦法之一，同時還能拓寬高附加值的鷹嘴豆產(chǎn)品。

近年來，功能性短肽的營養(yǎng)性、生理活性和應用價值已成為人們研究的熱點，功能性短肽在體內(nèi)比氨基酸更容易消化吸收[7-8]，還具有多種功能，如抗菌肽可調(diào)節(jié)免疫功能和殺死癌細胞[9]，抗氧化肽可以減少組織氧化[10]，保護機體。在我國，小麥肽已經(jīng)實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，目前采用單酶作為工具酶水解蛋白很難在短時間內(nèi)獲得高水解度、高得率的功能性短肽，如何實現(xiàn)鷹嘴豆短肽產(chǎn)業(yè)化，已成為亟待解決的技術問題[11]。遲曉星等[12]采用A.S1398中性蛋白酶水解大豆分離蛋白，水解時間為360 min，所得酶解液水解度10%。馬文鵬等[13]采用2709堿性蛋白酶水解鷹嘴豆分離蛋白，水解時間為360 min，所得酶解液水解度16.18%。周媛媛等[14]采用Protamex蛋白酶水解大豆分離蛋白，水解時間為240 min，所得酶解液水解度12.94%。劉冬等[15]采用菠蘿蛋白酶水解花生蛋白，發(fā)現(xiàn)水解時間382.68 min時酶解液水解度達23.40%。吳建中[16]采用Alcalase水解大豆蛋白，水解時間為300 min，所得酶解液水解度為12.7%，短肽得率70%，采用Protamex酶繼續(xù)水解Alcalase酶解物2 h，水解度可增至16%?？梢?，相比單酶水解，多酶分步酶解可提高短肽的得率和水解度。因此，本研究以堿溶酸沉得到的鷹嘴豆蛋白為原料，在鷹嘴豆蛋白堿性蛋白酶Alcalase水解研究的基礎上，篩選合適的酶繼續(xù)水解Alcalase水解物制備鷹嘴豆短肽，對進一步酶解工藝中的多種影響因素進行研究，利用氨基酸自動分析儀等測定鷹嘴豆短肽中的氨基酸組成及基本營養(yǎng)成分，評價鷹嘴豆短肽的營養(yǎng)價值，為鷹嘴豆短肽的產(chǎn)業(yè)化和進一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

鷹嘴豆蛋白，實驗室自制。

風味蛋白酶（Flavorzyme，1.2×105U/g）、堿性蛋白酶（Alcalase 2.4 L，2.80×105U/g），丹麥 Novozymes公司產(chǎn)品；木瓜蛋白酶（Papain，5.02×105U/g）、復合蛋白酶（Protamex，1.653×105U/g）、中性蛋白酶（Neutrase，2.236×105U/g），廣西南寧龐博生物工程有限公司產(chǎn)品；牛血清蛋白、福林酚試劑，購于北京市索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設備

TU-1810型紫外分光光度計，HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，AL204型天平，TDL-5-A型離心機，PHS-3C型pH計，K1301型自動定氮儀，ALPHA 1-2LD Plus型凍干機，LC-3A型氨基酸自動分析儀，Waters 600型高效液相色譜儀，TSK-GEL 2000 SWXL色譜柱。

1.2 方法

1.2.1 鷹嘴豆蛋白的制備

脫脂鷹嘴豆粉→堿溶（料液比 1∶10（g/mL），溫度 30℃，時間 90 min，pH 10.0）→離心（3 500 r/min，25min）→上層清液→酸沉（pH4.5）→離心（4000r/min，10 min）→真空冷凍干燥[17]。

1.2.2 蛋白酶的篩選

根據(jù)諾維信等公司提供各種蛋白酶最適作用范圍，在各種蛋白酶的最佳條件下水解45 min（表1），分別測定各酶解物的得率和水解度。

表1 蛋白酶酶解條件Table 1 Enzymolysis conditions of proteases

1.2.3 堿性蛋白酶Alcalase對鷹嘴豆蛋白的酶解

堿性蛋白酶Alcalase對鷹嘴豆蛋白的酶解條件為：水解溫度50℃，酶與底物濃度比（[E]/[S]）為2%，pH 8.0反應時間40 min[18]。

1.2.4 復合蛋白酶制備鷹嘴豆短肽單因素試驗設計

固定鷹嘴豆蛋白濃度為4%，在堿性蛋白酶Alcalase對鷹嘴豆蛋白酶解的條件上，其他因素基本條件為：中性蛋白酶和風味蛋白酶Flavourzyme用量比1∶1，酶總用量5 000 U/g，pH 7.0，反應溫度55℃，水解時間210 min，在此基礎之上考察復合酶用量（2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、7 000 U/g）、pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、酶解時間（90、120、150、180、210、240、270min）、酶解溫度（40、45、50、55、60、65、70 ℃）對水解度（DH）和短肽得率（TCA-NSI）的影響。反應結(jié)束后90℃保溫10 min滅酶，分別測定水解度和短肽得率。

1.2.5 響應面優(yōu)化試驗設計

采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面分析，以短肽得率（TCA-NSI）為響應值，對顯著性影響因素進行優(yōu)化，進而篩選出鷹嘴豆蛋白酶解的最優(yōu)條件。依據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，對復合酶添加量、pH、酶解溫度及酶解時間四個影響因素進行單因素試驗。以單因素試驗為基礎，確定出響應面試驗的因素和水平（表2）。

表2 響應面設計試驗因素水平及編碼表Table 2 Experimental factor level and coding table of response surface design

1.2.6 酶活力測定

采用改進的Folin-酚法進行測定[3]。

1.2.7 短肽得率測定

采用三氯乙酸(TCA)可溶性氮法[19]測定，短肽得率按下式計算：

式中：B為堿液體積，mL；Nb為堿液當量濃度，mol/L；?為氨基的解離度；Mp為底物中蛋白質(zhì)總量，g；Htot為底物蛋白質(zhì)中肽鍵總數(shù)，mmol/g蛋白（鷹嘴豆分離蛋白Htot=7.22）。

1.2.9 鷹嘴豆酶解蛋白肽粉一般營養(yǎng)成分的測定

水分：參照GB 5009.3—2016[21]進行測定；蛋白質(zhì)含量：參照GB 5009.5—2016[22]進行測定；脂肪含量：GB 5009.6—2016[23]進行測定；灰分：GB 5009.4—2016[24]進行測定；總糖：采用苯酚-硫酸法測定。

1.2.10 氨基酸組成測定

將鷹嘴豆短肽粉置于水解管中，加入6 mol/L的HCl溶液水解24 h，測定除色氨酸以外的氨基酸含量。其中色氨酸用NaOH堿水解后再測定。鷹嘴豆短肽粉營養(yǎng)價值評價[25-26]采用聯(lián)合國糧食和農(nóng)業(yè)組織（FAO）和聯(lián)合國世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的蛋白質(zhì)模式，氨基酸分(AAS)=1 g受試蛋白質(zhì)中氨基酸的毫克數(shù)×100/評分標準模式中相應必需氨基酸含量。

1.2.11 鷹嘴豆短肽分子質(zhì)量分布的測定

在柱溫30℃，流速0.5 mL/min，流動相（乙睛∶水∶二氟乙酸）=45∶55∶0.1（V∶V∶V），波長為 220 nm，色譜柱TSK-GEL 2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）的條件下，采用高效液相色譜（HPLC）對酶解物的分子量分布進行分析。

1.2.12 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，Tukey HSD檢驗進行數(shù)據(jù)多重比較，采用Origin Pro 8.0軟件進行數(shù)據(jù)制圖，Design Expert 8.0.6軟件進行響應面設計及結(jié)果分析。

式中：TCA-NSI為三氯乙酸可溶性氮得率，%；N1為在15%TCA中的可溶性氮含量，mg；N2為原料中的總氮含量，mg。

1.2.8 水解度（DH）的測定

采用pH-Stat法測定[20]，計算公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 鷹嘴豆短肽的一般營養(yǎng)成分

鷹嘴豆是一種脂肪含量較低、蛋白功效比值（PER）值較高、消化率較高的植物類食品，鷹嘴豆蛋白經(jīng)酶解后得到短肽粉，其一般營養(yǎng)成分如表3所示。由表3可知，酶解后的鷹嘴豆短肽粉仍是一種高蛋白、低脂肪的產(chǎn)品，其蛋白質(zhì)含量高達89.07%，脂肪低達0.86%，且水分和灰分都偏低。多糖是一種重要的生理活性物質(zhì)，是人體內(nèi)細胞進行代謝的能源，少量的多糖可以改善心臟和血液功能。

表3 鷹嘴豆短肽的一般營養(yǎng)成分（干基）Table 3 General nutrition components in the chickpea protein enzyme-hydrolysate powde（ron dry basis） 單位：%

2.2 蛋白酶的篩選

2.2.1 單一酶的篩選

酶種類是酶解過程中最重要的影響因素之一[27]。本試驗以多肽得率和水解度為評價指標，分別選用5種蛋白酶水解鷹嘴豆蛋白。由圖1可知，在各種蛋白酶的推薦使用條件下，復合蛋白酶、風味蛋白酶Flavourzyme、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶水解鷹嘴豆蛋白的TCA-NSI在36%~42%之間，DH在9%~12%之間，而堿性蛋白酶Alcalase水解鷹嘴豆蛋白的TCA-NSI、DH分別為55.60%±0.47%和15.21%±0.78%。因此，選擇堿性蛋白酶Alcalase為水解鷹嘴豆蛋白的工具酶進行第一步酶解。

2.2.2 復合酶的篩選

分別在各種酶的最適溫度和pH條件下，將中性蛋白酶與其他蛋白酶按質(zhì)量比1∶1兩兩復合，總用量為5 000 U/g，同時考察單獨使用中性蛋白酶的效果。由表4可以看出，中性蛋白酶與風味蛋白酶Flavourzyme復合酶解的TCA-NSI和DH均高于單一中性蛋白酶和其他兩種復合酶的酶解效果。因中性蛋白酶與風味蛋白酶Flavourzyme的最適pH相近，故試驗采用中性蛋白酶與風味蛋白酶Flavourzyme復合進行第二步酶解來制備鷹嘴豆短肽。

表4 不同蛋白酶復合對鷹嘴豆蛋白的酶解效果Table 4 The hydrolysis effect of different complex proteases on chickpea protein 單位：%

2.3 復合酶解制備鷹嘴豆短肽單因素試驗

2.3.1 酶添加量對水解的影響

由圖2可以看出，隨著酶添加量的增加，酶的水解作用加強，鷹嘴豆短肽的TCA-NSI與DH也隨之增加。當酶添加量在2 000～5 000 U/g時，酶解液的TCA-NSI和DH均隨酶添加量的增加而迅速升高，即酶解初期大分子蛋白迅速減少，小分子肽迅速增加，當酶添加量達到5 000 U/g時，短肽得率最高；若酶添加量繼續(xù)增加，酶的抑制作用會導致短肽得率有所下降[28]。根據(jù)酶動力學原理，酶的用量過少不利于水解，過多不僅水解效果差，還會造成資源浪費[29]。綜合考慮酶解效果和經(jīng)濟成本，選擇酶添加量在5 000 U/g左右。

2.3.2 pH對水解的影響

由圖3可知，體系pH在5.5～7.0范圍內(nèi)，水解物的TCA-NSI和DH的變化呈先增高后降低的趨勢；隨著pH的升高，TCA-NSI和DH迅速增加，當pH達到7.0時，體系的TCA-NSI和DH達到最高，當體系pH值在7.0以上時，TCA-NSI和DH呈現(xiàn)下降趨勢，即體系過酸或過堿都會破壞酶分子的空間結(jié)構(gòu)[30]。因中性蛋白酶和風味蛋白酶Flavourzyme在中性環(huán)境中酶解效果較好，故選擇pH7.0作為復合酶解的最適pH。

2.3.3 酶解時間對水解的影響

由圖4可知，在90～210 min范圍內(nèi)，短肽得率和水解度隨酶解時間的延長不斷升高，并于210 min后趨于平穩(wěn)，在酶解210 min時，短肽得率達到最大；當繼續(xù)延長水解時間，水解度趨于平緩，短肽得率呈下降趨勢，體系的短肽得率略有降低；這可能是由產(chǎn)物和底物抑制現(xiàn)象所引起，以致水解速度不再繼續(xù)升高，體系中的一些肽分子經(jīng)酶作用而被水解為氨基酸[28]。綜合考慮肽的得率和酶解時間成本，確定水解時間應控制在210 min左右。

2.3.4 酶解溫度對水解的影響

由圖5可知，在40～55℃時，隨著酶解溫度的升高短肽得率和水解度也隨之增大，且均在55℃時達到最高，超過55℃后體系短肽得率和水解度則迅速下降。這是因為溫度上升到一定程度會引起維持酶分子結(jié)構(gòu)的次級鍵解離，導致酶蛋白變性，從而使得酶活性降低[31]。因此，確定最佳酶解溫度為55℃左右。

2.4 響應面試驗設計及結(jié)果

響應面優(yōu)化試驗設計及結(jié)果見表5，利用Design Expert 8.0.6軟件對表5試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果見表6。

表5 響應面試驗設計及結(jié)果Table 5 Response surface test design and results

續(xù)表5 響應面試驗設計及結(jié)果Continue table 5 Response surface test design and results

表6 響應面試驗結(jié)果方差分析Table 6 Variance analysis of response surface test results

通過對表5試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析，得到以Y（得率）為目標函數(shù)與各因素變量酶添加量、pH、酶解時間、酶解溫度的二次多項回歸模型方程為：

Y=63.06+1.93A+0.092B+2.34C+0.62D-0.68AB-0.15AC+0.075AD+1.35BC+0.45BD+0.53D-1.41A2-2.42B2-5.10C2-3.73D2

由表6可知，建立的二次回歸模型方程是極顯著的（P＜0.01），失擬項P=0.799 5＞0.05，不顯著，說明建立短肽得率模型的擬合程度好，能較好地預測短肽得率，因變量與所考察自變量之間的線性關系顯著（R2=0.995 4），回歸模型校正決定系數(shù)R2Adj=0.990 8，即模型可解釋99.08%響應值的變化，表明模型擬合程度較好。0.59%的變異系數(shù)說明模型的重現(xiàn)性較好，說明本試驗所得二次回歸方程能很好地對響應值進行預測。在該模型中，回歸系數(shù)的顯著性檢驗顯示，一次項B對短肽得率的影響不顯著，一次項A、C、D極顯著（P＜0.01），一次項A顯著（P＜0.05），比較 4個因素（A、B、C、D）的F值大小可得，4個因素對短肽得率的影響依次為：酶解時間＞酶添加量＞酶解溫度＞pH。二次項（A2、B2、C2、D2）對試驗結(jié)果的影響極顯著（P＜0.01）；交互項（AB、BC、CD）對 TCA-NSI影響極顯著（P＜0.01）。所以，在以后的試驗中要考慮到各個因素之間的交互作用。

2.5 最佳酶解條件的確定及驗證

本試驗在單因素試驗的基礎上，通過DesignExpert 8.0.6統(tǒng)計軟件求解模型方程，試驗結(jié)果進行數(shù)學模擬和預測，最終得出鷹嘴豆蛋白質(zhì)的最佳酶解條件為：酶添加量5678.25U/g，pH7.0，酶解時間 216.75min，酶解溫度55.53℃，此時短肽得率為64.010%，最優(yōu)組合同單因素試驗結(jié)果基本一致。根據(jù)實際操作和生產(chǎn)應用，將上述最優(yōu)工藝條件調(diào)整為：復合酶添加量5 678 U/g，pH 7.0，酶解時間 216 min，酶解溫度 55 ℃。在修正后的工藝條件下，進行驗證性試驗，所得的短肽得率的平均值為63.79%，實際值與預測值相比，其相對偏差為0.34%，與堿性蛋白酶Alcalase單獨作用相比得率明顯提高。

2.6 鷹嘴豆短肽的氨基酸組成及營養(yǎng)評價

鷹嘴豆短肽粉得率為63.79%，必需氨基酸占總氨基酸的42.08%，同時富含呈味氨基酸（包括呈鮮味的天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu），呈甜味的甘氨酸（Gly）和丙氨酸（Ala）及與甜味有關的絲氨酸（Ser）和脯氨酸（Pro）），其氨基酸組成見表7。

由表8可知，與FAO/WHO推薦的必需氨基酸模式比較[32]，鷹嘴豆短肽粉中必需氨基酸種類齊全、含量豐富。對于鷹嘴豆短肽粉中必需氨基酸含量與成人需求量模式相比，其第一限制氨基酸是蛋氨酸（Met）和半胱氨酸（Cys），氨基酸分高達138.18；與學齡兒童需求量模式相比，其第一限制氨基酸是蘇氨酸（Thr），氨基酸分也高達103.25。通常，賴氨酸（Lys）是谷類蛋白質(zhì)的第一限制氨基酸，Met則是大多數(shù)非谷類植物蛋白質(zhì)的第一限制氨基酸，鷹嘴豆短肽粉中的Lys含量較高，將其作為營養(yǎng)補充劑添加于食品中，通過氨基酸的互補作用，能大大提高食品中蛋白質(zhì)的生物效價。因此，鷹嘴豆短肽粉對兒童、成人都是一種十分優(yōu)良的營養(yǎng)補充劑。

表7 鷹嘴豆短肽的氨基酸組成Table 7 Composition of amino acids in the chickpea oligopeptide

表8 鷹嘴豆酶解蛋白的必需氨基酸與FAO/WHO推薦模式比較Table 8 Comparison of essential amino acids of chickpea enzyme-hydrolysate and the FAO/WHO recommend pattern

2.7 鷹嘴豆短肽相對分子質(zhì)量分布

由圖6可知，鷹嘴豆短肽相對分子質(zhì)量呈不連續(xù)分布，相對分子量范圍在105～5 669 Da，且主要集中在1 000 Da以下。這表明鷹嘴豆蛋白在多種復合蛋白酶分步水解條件下酶解效果較好，根據(jù)肽類產(chǎn)品的等級評價，國際市場上相對分子質(zhì)量主要分布在1 000 Da以下的高純度大豆肽每噸高達到數(shù)十萬元，即低相對分子質(zhì)量分布的植物短肽具備極高的附加值。目前，國內(nèi)市場上尚未見到相關鷹嘴豆短肽產(chǎn)品。因此，本研究為高質(zhì)量鷹嘴豆短肽的產(chǎn)業(yè)化打下了良好的基礎。

3 結(jié)論

在單因素試驗的基礎上，運用響應面法對鷹嘴豆蛋白酶解工藝進行優(yōu)化，中性蛋白酶和風味蛋白酶Flavourzyme繼續(xù)酶解鷹嘴豆蛋白堿性蛋白酶Alcalase的酶解產(chǎn)物，體系的TCA-NSI與酶添加量（A）、酶解時間（C）及酶解溫度（D）極顯著相關，建立的回歸模型可信，確定了多酶分步酶解鷹嘴豆蛋白制備鷹嘴豆短肽的最佳工藝參數(shù)為：在堿性蛋白酶Alcalase水解鷹嘴豆蛋白40 min后加入中性蛋白酶和風味蛋白酶Flavourzyme繼續(xù)酶解216 min，堿性蛋白酶Alcalase添加量為5 000 U/g，pH 8.0，酶解溫度55℃，中性蛋白酶和風味蛋白酶Flavourzyme添加量為5 678 U/g，pH 7.0，酶解溫度55℃，在此條件下，短肽得率為63.79%±0.05%，水解度為26.74%±0.12%。采用酶解法對堿溶酸沉制備的鷹嘴豆蛋白進行深加工，真空冷凍干燥后得鷹嘴豆短肽，其蛋白含量高、脂肪低、必需氨基酸種類齊全、含量豐富。與FAO/WHO推薦的成人需求量模式相比，其第一限制氨基酸是蛋氨酸和半胱氨酸；與學齡兒童需求量模式相比，其第一限制氨基酸是蘇氨酸，氨基酸分分別高達138.18和103.25，必需氨基酸與非必需氨基酸比值（EAA/NEAA）為0.73，高于WHO和FAO參考標準值0.6。HPLC測定結(jié)果顯示，通過分步酶解制備的鷹嘴豆短肽大部分分子量在1 000 Da以下。上述研究可為鷹嘴豆蛋白進一步研究提供理論依據(jù)和工業(yè)化生產(chǎn)鷹嘴豆短肽提供參考。