韓志偉， 王宗玉， 鞠佳霓， 李科志， 鄔國斌， 林棟毅， 陳 闖

1 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院， 南寧 530021； 2 中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院， 廣州 510030

原發(fā)性肝癌中，肝細胞癌是最常見的類型，在世界范圍內(nèi)，肝細胞癌是第六大最常見的惡性腫瘤和第三大最常見的癌癥死亡原因[1]，肝癌復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差，嚴(yán)重威脅人類健康?，F(xiàn)階段肝癌治療方法以手術(shù)切除腫瘤、介入治療、全身治療和化療為主[2]。對于晚期多處轉(zhuǎn)移的患者多采用放射治療和化學(xué)藥物治療。然而耐藥性和不良反應(yīng)限制了化學(xué)藥物的應(yīng)用。中藥具有整體性、多靶點和相互協(xié)同的干預(yù)作用, 對慢性復(fù)雜性疾病具有改善預(yù)后、不良反應(yīng)輕等優(yōu)勢，成為治療肝癌的理想候選藥物[3]。

健脾消積方由太子參、黃芪、白花蛇舌草、太子參等中藥組成[4]。臨床上主要用于“肝郁脾虛”證肝癌患者的防治，具有穩(wěn)定瘤體、延長生存時間、改善患者生存質(zhì)量等作用，是體現(xiàn)“健脾理氣”法防治肝癌的方劑之一[5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)該方對肝癌細胞有較明顯的增殖抑制作用[6]，其機制尚不明確。

細胞自噬與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系，起著促進和抑制的雙重作用[7]。中藥通過整體和局部作用調(diào)控機體內(nèi)環(huán)境，這與自噬維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的過程相似[8]。本文將觀察健脾消積方水提物對肝癌細胞SMMC7721的增殖、凋亡及自噬的影響，檢測自噬流和自噬相關(guān)蛋白的變化，為探討該方對自噬的調(diào)控機制提供實驗依據(jù)。本研究方案經(jīng)過廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會審批(批號：LW2019059)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 主要試劑 胎牛血清FBS(?？寺?；DMEM(康寧)；CellTiter-Glo(普洛麥格)；LC3A/B抗體、Beclin1抗體和P62抗體(CST公司)；Agilent RNA 6000 Nano Kit、Trizol試劑盒(吉凱基因)；TB Green Premix Ex TapⅡ (TAKARA公司)；PrimeScriptTM RT reagent Kit(TAKARA公司)；抗兔、抗鼠抗體(賽默飛)；過表達SensGFP-StubRFP-LC3的自噬檢測慢病毒(吉凱基因)。

1.1.2 主要儀器 熒光顯微鏡(奧林巴斯)；倒置顯微鏡(上海蔡康)；共聚焦顯微鏡(日本橫河)；Thremo Nanodrop 2000 (賽默飛) ；Agilent 2100 (安捷倫) ；Nanodrop 2000(賽默飛)。

1.1.3 復(fù)方凍干粉制作 健脾消積方的中藥藥材均購自廣西仙茱中藥科技有限公司。采用“正交法”提取該方的水提物，再作成凍干藥粉，對該方的提取物有較好的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，以便能對實驗結(jié)果進行重復(fù)。每克健脾消積方凍干粉含生藥 8.37 g。取制備好的凍干粉用DMEM培養(yǎng)基配置含藥培養(yǎng)液，37 ℃水浴鍋溶解，離心后用0.22 μm過濾器過濾除菌，分裝,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞株SMMC7721由廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中心實驗室提供。將人肝癌細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，觀察細胞生長狀態(tài)，1～2 d換液1次，2～3 d用0.25%胰酶消化后傳代。

1.2 CCK-8法測定SMMC7721細胞增殖情況 將SMMC7721細胞接種于96孔板，每孔約3000個細胞，設(shè)置3個復(fù)孔。取適量含藥培養(yǎng)液稀釋，按測得IC50的濃度配制備用。取1500 μg/ml的含藥培養(yǎng)液按照每孔100 μl作用于肝癌SMMC7721細胞，另設(shè)空白對照組。加藥后24～96 h(每24 h換藥1次)后進行CCK-8檢測。培養(yǎng)終止前每孔加10 μl CCK-8溶液，酶標(biāo)儀檢測450 nm吸光度值，計算增殖倍數(shù)。

1.3 流式細胞學(xué)測定SMMC-7721細胞的凋亡 取SMMC-7721 細胞，給予終濃度為1500 μg/ml的含藥培養(yǎng)液，對照組加相同體積的培養(yǎng)基；于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，檢測第5天的凋亡率。細胞消化洗滌后，加入 1×binding buffer 洗滌細胞沉淀1次，再加入200 μl 1×binding buffer 重懸細胞沉淀，將細胞轉(zhuǎn)移到2 ml EP管中。充分混勻后，分別加入10 μlAnnexin V-APC 染色和5 μl Propidium Iodide并混勻，最后以濾網(wǎng)過濾各組樣品，并轉(zhuǎn)至新的流式管內(nèi)，避光反應(yīng)半小時后，15 min內(nèi)上機檢測。使用流式細胞儀分析軟件Guava InCyte進行結(jié)果分析。

1.4 Western Blot檢測Beclin1、 LC3和p62蛋白的表達 取適量含藥培養(yǎng)液按1500 μg/ml、2100 μg/ml的濃度稀釋，設(shè)對照組。細胞加藥處理48 h，收集細胞懸液，提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度。各孔加入20 μg 蛋白樣品，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜，50 g/L脫脂奶粉封閉 2 h。4 ℃孵育Beclin1、LC3、p62抗體過夜。次日室溫孵育二抗 1 h后用TBST 洗滌3次，用化學(xué)發(fā)光法顯影曝光，圖片經(jīng) Image lab 軟件分析灰度值。

1.5 SensGFP-StubRFP-LC3慢病毒轉(zhuǎn)染SMMC7721細胞檢測自噬流 將構(gòu)建好的SensGFP-StubRFP-LC3慢病毒轉(zhuǎn)染SMMC7721細胞，轉(zhuǎn)染24 h后,連續(xù)3 d使用嘌呤霉素(2 μg/ml)篩選未感染細胞并清除。之后將細胞接種至96孔板中(4000個/孔，每組3復(fù)孔)。次日待細胞貼壁后，加入適量1500 μg/ml的含藥培養(yǎng)液，另設(shè)空白對照組。待藥物干預(yù)細胞48 h后，加入Hochest對細胞核進行染色，并立即置于CQ1中使用SensGFP、StubRFP和Hochest三通道進行掃板，采用CQ1的“two colour dots in cellbody”模式進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 健脾消積方水提物抑制肝癌SMMC7721細胞增殖

健脾消積方水提物干預(yù)SMMC7721細胞達到半數(shù)抑制的濃度約為1500 μg/ml，分別干預(yù)肝癌SMMC7721細胞24 h、48 h、72 h、96 h后，結(jié)果顯示，健脾消積方水提物抑制肝癌SMMC7721細胞增殖，加藥干預(yù)后不同時間細胞增殖倍數(shù)與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.001)(表1)。

2.2 健脾消積方顯著促進SMMC7721細胞的凋亡 與對照組(1.74%±0.07%)相比，加藥組細胞的凋亡(14.83%±0.53%)明顯升高，活細胞比率明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-42.629，P<0.001)。

2.3 自噬相關(guān)蛋白表達的檢測結(jié)果 檢測結(jié)果見圖1。

表1 健脾消積方水提物對SMMC7721細胞增殖的影響

圖1各組肝癌SMMC7721細胞Beclin1、LC3和p62蛋白表達的電泳圖

加藥組Beclin1的表達明顯下調(diào)，Beclin1作用于自噬的上游，對調(diào)控自噬具有重要作用，Beclin1的下調(diào)表明細胞的自噬過程可能受到了抑制。LC3I變化趨勢不明顯，LC3Ⅱ的表達隨劑量增加而升高，并且LC3Ⅱ的表達明顯高于同一樣品LC3I水平，提示加藥組細胞可能促進LC3I向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化。LC3Ⅱ由LC3I酯化后形成并聚集在自噬體膜上，其含量與自噬體的數(shù)量成正比，是自噬體生成的標(biāo)志性蛋白[9]。因此，LC3Ⅱ表達量的提高提示自噬小體增多[10]，提示健脾消積方水提物促進了SMMC7721細胞自噬體的生成。不同濃度健脾消積方水提物培養(yǎng)液組p62基因的蛋白表達量與溶劑對照組相比有所上升。p62是自噬體降解的底物之一，p62經(jīng)過泛素化蛋白修飾后與自噬體結(jié)合形成自噬流[11-12]，并在自噬體和溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體后被降解清除[13-14]。本研究中p62蛋白表達水平增高提示健脾消積方可能阻滯了SMMC7721細胞的自噬流。

2.4 健脾消積方水提物SMMC7721細胞自噬流的檢測

隨著自噬的發(fā)生，LC3帶動SensGFP和StubRFP熒光蛋白聚集在自噬相關(guān)的雙層膜結(jié)構(gòu)中，并在共聚焦顯微鏡下形成熒光點。在自噬體對應(yīng)的熒光點中，SensGFP和StubRFP各自發(fā)出綠色和紅色的熒光。在自噬溶酶體對應(yīng)的熒光點中，雖然SensGFP、StubRFP和LC3均存在，但由于SensGFP在酸性環(huán)境中熒光易淬滅，因此僅存在StubRFP發(fā)出的紅色熒光[15-17]。細胞中紅色熒光點的數(shù)目代表自噬體和自噬溶酶體的總數(shù)量，綠色熒光點的數(shù)目代表自噬體的數(shù)量，兩者的相對數(shù)量代表自噬流從自噬體到自噬溶酶體的流動速度。與對照組相比，加藥組(1500 μg/ml和2100 μg/ml組)的紅色熒光點和綠色熒光點明顯增多(P值均<0.05)。合并圖像中，黃斑點均顯著增加，呈現(xiàn)紅色的自由紅色斑點減少 (圖2)。相比對照組組，兩個加藥干預(yù)組紅色熒光/綠色熒光相對值顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.001)(表2)。提示健脾消積方藥物可能抑制了自噬體向自噬溶酶體的流動。

圖2 健脾消積方水提物干預(yù)SMMC7721細胞自噬流檢測的熒光圖像

表2 不同處理組紅色熒光/綠色熒光相對表達量

注：與對照組比較，1)P<0.001。

3 討論

眾多研究表明，中草藥及其有效成分具有調(diào)控細胞自噬水平的抗腫瘤作用，包括通過自噬誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥[18]、調(diào)節(jié)腫瘤免疫發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[19-20]。為了探究健脾消積方水提物對肝癌SMMC7721細胞自噬的影響,本研究檢測了自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3和p62的表達。

健脾消積方水提物干預(yù)細胞后，Beclin1蛋白表達明顯下調(diào)，表明細胞自噬過程受到了抑制。Beclin1是Bcl-2的同源蛋白，是上游的自噬啟動蛋白，和Bcl-2具有相同的BH3結(jié)構(gòu)域，Beclin1不僅可以調(diào)控自噬，還可能通過Bcl-2發(fā)揮調(diào)控凋亡的效應(yīng)[21]。LC3是自噬體膜上的標(biāo)志性蛋白，在自噬過程中，胞漿型LC3Ⅰ會被包括Atg7和Atg3在內(nèi)的泛素樣體系所修飾和加工，產(chǎn)生膜型 LC3Ⅱ[22]。LC3Ⅱ是檢測自噬泡形成的特異性標(biāo)志性蛋白，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值變化可以評價自噬體的形成[23]。實驗結(jié)果顯示，健脾消積方水提物處理肝癌SMMC7721細胞，加藥組自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ表達明顯增加，提示健脾消積方水提物可誘導(dǎo)LC3Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3Ⅱ，即自噬體生成增多。p62是檢測自噬流活性的標(biāo)志性蛋白之一，用來評價自噬和自噬流的強弱。細胞自噬過程依賴于溶酶體的功能，p62結(jié)合泛素化蛋白進入到自噬體后最終與溶酶體融合形成自噬溶酶體從而得到清除[5]。本研究中給藥組p62表達上調(diào)，提示健脾消積方水提物可能抑制了自噬體與溶酶體的結(jié)合，阻礙肝癌SMMC7721細胞自噬體的降解和清除。為了分別評估自噬體和自噬溶酶體積累的程度，研究中給細胞轉(zhuǎn)染了包含串聯(lián)熒光SensGFP-StubRFP-LC3的腺病毒來檢測自噬流。檢測結(jié)果顯示48 h后，相比對照組，加藥組紅色熒光和綠色熒光相對數(shù)量下降，即自噬溶酶體減少。證實了健脾消積方水提物阻滯了自噬體向自噬溶酶體的流動。自噬體無法降解導(dǎo)致了自噬體的堆積，而細胞內(nèi)自噬體的大量堆積最終導(dǎo)致了肝癌SMMC7721細胞的死亡。關(guān)于健脾消積方在自噬上游通路如何誘導(dǎo)肝癌細胞自噬，調(diào)控細胞自噬性死亡，發(fā)揮抗癌效應(yīng)還需進一步探索。

綜上，健脾消積方水提物能夠使肝癌SMMC7721細胞Beclin1蛋白表達上調(diào)，LC3Ⅱ和p62表達下調(diào)，同時阻滯自噬流。其抗肝癌機制可能是通過促進自噬體生成，抑制自噬體溶解，從而使細胞內(nèi)自噬體大量堆積而導(dǎo)致的細胞死亡。