劉方超 陳穎 董冰子 付正菊 王顏剛 胡建霞

青島大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 青島 266000

1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)由于胰島素絕對(duì)不足，引起蛋白質(zhì)合成代謝障礙，高血糖引起多尿造成的鈣、磷、鎂從尿中大量丟失，致使患者骨量減少甚至骨質(zhì)疏松，骨折風(fēng)險(xiǎn)較一般人群顯著增加。隨著醫(yī)療技術(shù)水平的提升，T1DM患者生存期明顯延長(zhǎng)，其骨骼損害被日益關(guān)注。T1DM多為青少年或兒童起病，針對(duì)該人群骨質(zhì)疏松癥的治療經(jīng)驗(yàn)較為有限，現(xiàn)有手段主要為控制血糖及鈣劑、維生素D補(bǔ)充治療。然而上述藥物的具體使用劑量尚未統(tǒng)一，治療效果尚不完全明確。白藜蘆醇是一種中藥單體，研究發(fā)現(xiàn)其具有優(yōu)良的抗氧化和抗炎作用，能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。因此，本研究旨在通過構(gòu)建T1DM骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型，研究白藜蘆醇對(duì)T1DM鼠并發(fā)骨破壞的治療作用，為臨床治療青少年T1DM合并的骨損害提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性NOD小鼠，體質(zhì)量20～24 g，6～8周齡，購自南方模式動(dòng)物有限公司。相對(duì)濕度40%～50%，室溫22℃～25℃，自由進(jìn)食及飲水。12 h日光交替照射。經(jīng)檢測(cè)NOD小鼠按隨機(jī)表方法分為：(1)糖尿病組(DM組，n=6)：糖尿病發(fā)病后用0.9%氯化鈉溶液灌胃；(2)胰島素組(INS組，n=6)：發(fā)病后每日予甘精胰島素皮下注射治療，劑量為0.2～0.4 U/kg，根據(jù)當(dāng)日血糖進(jìn)行調(diào)整；(3)白藜蘆醇組(RESV組，n=6)：于發(fā)病后第3天予RESV 200 mg/(kg·d)灌胃；(4)飼養(yǎng)8周后，未發(fā)病的NOD小鼠作為正常對(duì)照組(N組，n=6)。

1.2 Micro-CT檢測(cè)

治療8周后脫頸處死小鼠，右側(cè)股骨70%乙醇固定，進(jìn)行Micro-CT掃描(eXplore Locus User Guide，GE)，對(duì)骨組織各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行分析。

1.3 股骨切片堿性磷酸酶染色(偶氮偶聯(lián)法)

左側(cè)股骨10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣液脫鈣21 d后，石蠟包埋、切片行堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色(堿性磷酸酶染色液，Solarbio)。低倍鏡(×100倍)下觀察骨小梁形態(tài)，高倍鏡(×400倍)計(jì)數(shù)骨股頭骨小梁內(nèi)成骨細(xì)胞數(shù)目。

1.4 骨組織內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)：OCN、Runx2、PPARr、TRAP mRNA表達(dá)

實(shí)時(shí)定量熒光定量 PCR(RT-PCR)檢測(cè) OCN、Runx2、PPARr、TRAP mRNA的表達(dá)。將小鼠股骨組織沖洗干凈骨髓腔，稱取質(zhì)量后，加入適量TRIzol，按試劑盒說明書提取總RNA。取2 μL總RNA，加入5*PrimeScript Buffer(for real time)2 μL；PrimeScript RT Enzyme MixI 0.5 μL；Oligo dT Primer 0.5 μL；Random 6 mers 0.5 μL；RNase Free dH2O 4.5 μL。反應(yīng)液震蕩離心10 s，使其聚集于EP管底部。在PCR儀上按下列條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

RT-PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s(升溫速率為4.4 ℃/s)1循環(huán)；95 ℃ 5 s(升溫速率4.4 ℃/s)、60 ℃ 30 s(升溫速率2.2 ℃/s) 40循環(huán)；95 ℃ 5 s(升溫速率4.4 ℃/s)、60 ℃ 1 s(升溫速率2.2 ℃/s) 95 ℃ 5 s(升溫速率 0.11 ℃/s)。反應(yīng)結(jié)束后記錄各樣本CT值。PCR結(jié)果定量用ΔΔCT法，CT=目的基因CT-內(nèi)參基因CT，以正常組作為對(duì)照樣本，ΔΔCT=觀察樣本ΔCT-對(duì)照樣本ΔCT。樣本的相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCT。檢測(cè)骨組織相關(guān)基因引物序列見表1。

表1 檢測(cè)骨組織表達(dá)基因引物序列Table 1 Primer sequences of expressed genes in bone tissues

注：以上引物均委托深圳華大基因科技有限公司合成。

血清酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)檢測(cè)(ELISA法)小鼠內(nèi)眥取血室溫靜置30 min，2 000 r/min離心15 min，取上層血清。ELISA法檢測(cè)血清酸性磷酸酶量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 13.0軟件分析，數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間差異用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 骨組織Micro CT結(jié)果

2.1.1Micro CT參數(shù)：骨組織3D參數(shù)分析(圖1)顯示，與正常組相比，糖尿病組骨密度(bone mineral density，BMD)降低(P=0.015)，骨體積百分比(BV/TV)降低(P=0.049)；與糖尿病組相比，白藜蘆醇治療組BMD升高(P=0.008)，BV/TV升高(P=0.014)、骨表面密度(BS/TV)增加(P=0.016)，結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(structural model index，SMI)升高(P=0.029)；與胰島素治療組相比，白藜蘆醇治療組骨小梁數(shù)目(Tb.N.)明顯增加(P=0.018)。

圖1 各組間骨組織Micro-CT參數(shù)Fig.1 Micro-CT parameters of the bone tissue in each group注：BMD：骨密度；BMC：骨礦物質(zhì)含量；SMI：股骨結(jié)構(gòu)模型指數(shù)；Calib.Tb.Th.3D：三維校準(zhǔn)骨小梁厚度；Calib.Tb.Sp.3D：三維校準(zhǔn)骨小梁分離度；BV/TV：骨體積分?jǐn)?shù)；Tb.N：骨小梁數(shù)目。

2.1.2骨組織Micro-CT平片：從骨組織2D平片縱切面上觀察(圖2)，與正常組相比，DM組皮質(zhì)骨變薄，骨髓腔相對(duì)擴(kuò)大。與DM組相比，RESV組、INS組皮質(zhì)骨致密。由圖2C可見，與正常組相比，DM組骨股頭骨小梁數(shù)量明顯減少。與DM組相比，RESV組、INS組骨小梁增多。

圖2 骨組織Micro-CT平片圖像 A：股骨縱切面，觀察皮質(zhì)骨及骨小梁差別；B：取股骨中段切面觀察皮質(zhì)骨厚度；C：股骨頭正中切面觀察骨小梁差別。Fig.2 Micro-CT plain film image of the bone tissue. A: The difference of cortical bone and trabecula was observed in longitudinal section of the femur; B: The thickness of cortical bone was observed in midsection of the femur; C: The difference of trabecula was observed in median section of the femoral head.

2.1.3股骨頭骨小梁重建：骨組織Micro-CT應(yīng)用Image J軟件對(duì)股骨頭部分進(jìn)行重建(圖3A)。DM組骨小梁形態(tài)模糊，數(shù)量減少、變細(xì)、中斷，殘端游離，小梁間距增寬。INS組及RESV組骨小梁相互連接成立體網(wǎng)狀，小梁表面光滑，小梁間距小。各組間骨小梁數(shù)目經(jīng)Micro-CT掃描結(jié)果見圖3B，結(jié)果表明，DM組骨小梁數(shù)量明顯減少(P=0.018)，INS組、RESV組與正常組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 股骨頭骨小梁重建及參數(shù)比較 A：股骨頭骨小梁重建；B：各組骨小梁數(shù)目統(tǒng)計(jì)。Fig.3 Trabecular reconstruction of the femoral head and comparison of the parameters. A: Trabecular reconstruction of the femoral head; B: Statistics of trabecular number in each group.

圖4 骨組織切片ALP染色比較成骨細(xì)胞 A：ALP染色，成骨細(xì)胞；B：各組間成骨細(xì)胞數(shù)量比較。Fig.4 The osteoblasts were compared using ALP staining in bone tissue sections. A: ALP staining, osteoblasts; B: Comparison of the number of osteoblasts among groups.

2.2 骨組織切片并ALP染色

骨組織切片ALP染色可見，糖尿病組骨小梁結(jié)構(gòu)雜亂、變細(xì)，胰島素治療及白藜蘆醇治療組骨小梁結(jié)構(gòu)完整連續(xù)。各組分別取連續(xù)3張切片，應(yīng)用Image J統(tǒng)計(jì)切片中股骨頭處的成骨細(xì)胞，計(jì)算其平均值進(jìn)行比較，結(jié)果(圖4)顯示，糖尿病組成骨細(xì)胞明顯減少，胰島素治療組成骨細(xì)胞數(shù)目略多于白藜蘆醇治療組。

2.3 骨重建相關(guān)基因mRNA RT-PCR檢測(cè)

各組骨組織相關(guān)基因mRNA RT-PCR相對(duì)表達(dá)量結(jié)果(圖5)可見：DM組TRAP、PPAR-G相對(duì)表達(dá)量增加(P=0.032、0.013)；與DM組相比，INS組TRAP、PPAR-G相對(duì)表達(dá)量降低(P=0.025、0.017)，Runx2相對(duì)表達(dá)量增加(P=0.030)；RESV組TRAP、PPAR-G表達(dá)量降低(P=0.013、0.028)，Runx2表達(dá)量增加(P=0.034)。

圖5 各組間骨重建相關(guān)基因mRNA RT-PCR相對(duì)表達(dá)量比較Fig.5 Comparison of RT-PCR results of relative expression of bone remodeling-related genes among different groups

2.4 血清TRACP檢測(cè)比較

正常組、DM組、INS組、RESV組小鼠血清TRACP檢測(cè)結(jié)果分別為(15.24±0.85) μg/mL、(18.38±0.76) μg/mL、(13.84±1.02) μg/mL、(13.08±0.93) μg/mL。與正常組相比，DM組血清TRACP水平明顯升高(P=0.026)；與DM組相比，INS組TRACP水平明顯降低(P=0.019)；與DM組相比，RESV組TRACP水平明顯降低(P=0.009)。

3 討論

T1DM降低骨密度并增加脆性骨折風(fēng)險(xiǎn)的主要原因是骨形成減少，然而1型糖尿病對(duì)骨吸收的影響存在爭(zhēng)議。Tsentidis等[1]通過對(duì)T1DM兒童和青少年骨代謝研究發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞相關(guān)信號(hào)減低，而s-RANKL等破骨細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)增加。Peng等[2]研究發(fā)現(xiàn)，T1DM小鼠表現(xiàn)出成骨細(xì)胞數(shù)量/骨表面積、礦物結(jié)合率減低，NF-κB配體受體表達(dá)下降，這些因素共同作用引起骨吸收受損。近年來研究表明，PPAR-G基因缺失可通過增加骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族成員的產(chǎn)生和分泌來促進(jìn)骨形成并減少骨吸收，從而增加小鼠骨密度[3]。與之相反，PPAR-G激活劑(如噻唑烷二酮類)通過增加骨硬化蛋白的表達(dá)抑制骨形成[4]。本研究結(jié)果顯示T1DM小鼠骨組織骨小梁變細(xì)、數(shù)量減少，成骨細(xì)胞數(shù)量減少結(jié)合OCN、Runx2基因下調(diào)，符合骨形成減少，PPAR-G、TRAP基因表達(dá)增加，表明骨吸收增加。本研究表明，T1DM骨破壞是骨形成減少、骨吸收增加二者共同作用的結(jié)果。然而，T1DM引起的成骨減少、破骨增加，二者孰輕孰重、發(fā)生的時(shí)間前后關(guān)系以及補(bǔ)充VitD和鈣劑是否能延緩甚至避免這些事件的發(fā)生，這些問題尚需要進(jìn)一步研究。

T1DM繼發(fā)的骨損害是通過多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)的，血管生成損傷[5]，糖尿病微血管病變[6-7]，慢性血糖控制不佳[8]等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，C肽替代治療可以改善糖尿病相關(guān)并發(fā)癥[9]。Russo等[10]研究發(fā)現(xiàn)C肽可激活人類成骨細(xì)胞樣細(xì)胞(Saos-2)中的ERK1/2途徑，增加I型膠原，參與骨重建過程。因此，T1DM患者繼發(fā)的骨損害是無法完全通過胰島素替代治療來改善的。本研究發(fā)現(xiàn)，胰島素治療后的T1DM小鼠骨組織中，雖然OCN、Runx2基因上調(diào)明顯，仍存在骨小梁變細(xì)、數(shù)量減少以及成骨細(xì)胞減少，表明胰島素在改善糖尿病骨損害上仍有局限性。

研究表明，常規(guī)補(bǔ)充鈣劑及VitD對(duì)治療T1DM骨損害作用有限。阿侖膦酸短期治療可抑制成骨細(xì)胞凋亡來預(yù)防T1DM鼠骨損害，長(zhǎng)期治療可以增加骨密度但是以抑制骨形成為代價(jià)的[11]。同時(shí)，美國食品藥品監(jiān)督管理局未批準(zhǔn)阿侖膦酸用于兒童。因此，用于治療T1DM青少年骨損害的方法非常少。

近年來，研究者逐步探求新的骨損害治療方法。Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)益生菌治療T1DM鼠骨損害的新途徑。Zhang等[13]研究發(fā)現(xiàn)枸杞子乙醇提取物通過對(duì)十二指腸鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和腎臟CaSR的調(diào)節(jié)作用從而減輕T1DM小鼠高鈣尿并防止骨小梁退化，同時(shí)發(fā)現(xiàn)石榴籽提取物具有減輕糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的小鼠骨丟失和高鈣尿[14]。Pino等[15]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇在治療T1DM鼠合并骨外傷時(shí)，具有獨(dú)立于胰島素治療以外的促成骨作用。本研究更進(jìn)一步表明，白藜蘆醇在治療繼發(fā)于T1DM的骨損害具有積極作用，其作用可能是從多方面實(shí)現(xiàn)的，除外已被證實(shí)的降糖、抗氧化作用外，本研究發(fā)現(xiàn)其上調(diào)Runx2、OCN基因，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，防止繼發(fā)于糖尿病的成骨細(xì)胞凋亡；PPAR-G基因下調(diào)同時(shí)表明白藜蘆醇有抑制骨髓干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的作用。白藜蘆醇促進(jìn)成骨的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步明確。

總之，T1DM引起的成骨細(xì)胞數(shù)量減少，成骨活性減弱，破骨活性增強(qiáng)，骨髓干細(xì)胞脂肪化是繼發(fā)骨損害的主要原因。目前，治療青少年骨損害方法有限，白藜蘆醇可以從多角度增加成骨細(xì)胞數(shù)量、增加成骨細(xì)胞活性、減少骨吸收，或?qū)⒊蔀榕R床治療繼發(fā)于糖尿病的骨損害的有效方法。