蔣國紅 張駿 王長明 張麗

(遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州 遵義 563003)

叉頭轉(zhuǎn)錄因子O亞型(FoxO)3a是胰島素樣生長因子(IGF)-1-磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)-蘇氨酸蛋白激酶(AKT)信號通路下游重要的轉(zhuǎn)錄因子，其上游受PI3K-AKT磷酸化級聯(lián)通路的調(diào)節(jié)，下游調(diào)節(jié)靶基因，在DNA損傷修復、細胞能量代謝、細胞周期停滯、細胞凋亡、細胞自噬、衰老等方面起到重要作用〔1，2〕。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子p53、Yin-Yang(YY)1等均能夠調(diào)控朊蛋白管家基因(PRNP)表達，但FoxO3a是否能調(diào)控PC12細胞中PRNP基因表達尚無相關(guān)報道〔3，4〕。為此，本研究擬探討FoxO3a對PC12細胞PRNP表達調(diào)控的影響。

1 材料和方法

1.1實驗細胞及主要試劑 PC12及293T細胞購自中山大學實驗中心細胞庫；胎牛血清購自Hyclone公司；Trizol購于Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司；朊蛋白(PrP)、β-actin一抗抗體購自Santa Cruz公司；小量質(zhì)粒抽提試劑盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自Promega公司；FoxO3a siRNA轉(zhuǎn)染套裝購自廣州銳博生物科技有限公司；pcDNA3.1-FoxO3a質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建并保存；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司。

1.2細胞培養(yǎng) 將PC12細胞培養(yǎng)于10%滅活胎牛血清，雙抗青霉素終濃度為100 μg/ml、鏈霉素為100 μg/ml的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每24 h更換培養(yǎng)液，約2 d傳代一次，取生長狀態(tài)良好、細胞長滿培養(yǎng)瓶壁80%后的細胞用胰酶消化后傳代。

1.3siRNAs 基因沉默實驗 根據(jù)FoxO3a亞基的mRNA序列，設(shè)計3條siRNA序列及陰性對照探針(見表1)，由上海吉瑪生物制藥技術(shù)有限公司設(shè)計并合成，其中陰性對照探針序列與目的靶細胞中其他基因沒有同源性。當細胞密度達到50%～60%時，采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000進行瞬時轉(zhuǎn)染，24 h后實時熒光聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測FoxO3a基因表達情況，篩選出抑制效率最好的siRNA序列。實驗分為空白對照組、陰性對照組、siRNA(S1、S2、S3)組，再進行轉(zhuǎn)染，24 h后RT-PCR檢測PRNP表達情況。

表1 FoxO3a的siRNA模板序列

1.4RT-PCR 按TRizol試劑盒說明書提取細胞的總RNA，用DNase Ⅰ對RNA進行處理。GenBank上查找目的基因mRNA序列，在蛋白編碼區(qū)(CDS)設(shè)計特異性引物：FoxO3a上游引物：5′-CGGCTCACTTTGTCCCAGAT-3′，下游引物：5′-GGCGGATGGAGTTCTTCCA-3′；PRNP上游引物：5′-GGAGAACTTCACGGAGACCG-3′,下游引物：5′-CTCCCGTCGTAATAGGCCTG-3′；GAPDH上游引物：5′-AGGGCTGCCTTCTCTTGTGA-3′，下游引物：5′-AACTTGCCGTGGGTAGAGTCA-3′。逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR綠熒光染料法。

1.5Western印跡 利用放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液從細胞提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)定量法測定蛋白濃度，蛋白上樣量為40 μg，12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，然后將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，孵育AKT/磷酸化(p)AKT、FoxO3a/pFoxO3a、GAPDH一抗，4℃過夜，TBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠/山羊抗兔二抗室溫孵育2 h，洗膜、化學發(fā)光、顯影、掃描，凝膠分析系統(tǒng)分析蛋白表達的灰度值變化。蛋白表達量以各組灰度值占對照組灰度值的比值來表示。

1.6雙熒光素酶報告基因檢測試驗

1.6.1載體構(gòu)建 針對PRNP-3′非翻譯區(qū)(UTR)設(shè)計并合成擴增引物序列(上游：5′-GATCGAGCATGGTCCTCTTC-3′，下游：5′-GGTGCTCATCTTCGCTC-GTTTA-3′)，采用20 μl體系，循環(huán)參數(shù)為94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min 30 s，30個循環(huán)；72℃ 3 min。將PCR擴增得到的PRNP啟動子片段連接于pMD18-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α細菌，測序證實后，純化回收，酶切，克隆入pGL3-Basic載體，構(gòu)建pG3L-PRNP報告基因載體。同樣方式構(gòu)建pcDNA3.1-FoxO3a表達載體，引物序列：上游5′-CCCAAGCTTACCATGGCAGAGGCACCGGCTT-3′，下游5′-CATGTCTAGATCAGCCTGGCACCCAGCTC-3′。構(gòu)建的載體將通過測序檢測是否正確。

1.6.2報告基因轉(zhuǎn)染及熒光素酶(Luc)活性的測定 將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞〔海腎熒光素酶pRL系列(pRL-TK)質(zhì)粒作為內(nèi)參〕，3個復孔檢測，采用雙熒光報告基因法檢測Luc活性，進而評估啟動子的活性，轉(zhuǎn)染的組別如下：基礎(chǔ)對照組(pGL3-Basic+pRL-TK)、陽性對照組(pGL3-Control+pRL-TK)、實驗組Ⅰ(pGL3-PNRP+pRL-TK)、實驗組Ⅱ(pGL3-PNRP+pcDNA3.1-FoxO3a+pRL-TK)、pcDNA3.1(+)空載體對照組〔pGL3-PNRP+pcDNA3.1(+)+pRL-TK〕、FoxO3a質(zhì)粒對照組(pGL3-Basic+pcDNA3.1-FoxO3a+pRL-TK)，共6組。轉(zhuǎn)染24 h后，吸去細胞培養(yǎng)上清，PBS洗滌1次；每孔加入200 μl裂解液，搖床緩慢裂解15 min，12 000 r/min離心10 min，上清轉(zhuǎn)至新的離心管；取20 μl上清液加入100 μl Luc檢測試劑Ⅱ測量螢火蟲熒光素酶(FLuc)活性，再加入100 μl Stop & GloTM測定海腎熒光素酶(RLuc)活性,FLuc/RLuc即相對Luc活力值。所有試驗重復3次，取平均值。

1.7統(tǒng)計學分析 采用SPSS23.0軟件進行獨立樣本t檢驗、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1FoxO3a基因 siRNAs轉(zhuǎn)染效率 FoxO3a基因抑制后其siRNAs相對表達水平分別為0.36±0.16(S1組)、0.74±0.21(S2組)、0.57±0.18(S3組)。與空白對照組(1.00±0.13)相比，S1探針的抑制率最高，后續(xù)試驗選用S1探針。

2.2FoxO3a基因沉默對PRNP基因表達的影響 與陰性對照組相比，S1組PRNP基因顯著升高(1.81±0.32 vs 1.00±0.16，P<0.05)。陰性對照組與空白對照組(0.96±0.21)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3FoxO3a基因沉默對朊蛋白(PrP)表達的影響 如圖1所示，與空白對照組相比，陰性對照組的PrP表達情況未發(fā)生明顯改變，而S1組FoxO3a基因被沉默后，PrP表達顯著升高，與基因水平一致。

1～3：空白對照組、陰性對照組、S1組圖1 各組FoxO3a基因沉默后PrP表達

2.4載體構(gòu)建及雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果 pGL3-PNRP及pcDNA3.1-FoxO3a載體經(jīng)酶切及測序鑒定，結(jié)果完全正確，構(gòu)建成功。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，與基礎(chǔ)對照組相比，陽性對照組FLuc/Rluc值明顯提高(2.459±0.244 vs 0.204±0.112)，實驗組Ⅰ的FLuc/Rluc值(1.453±0.315)也顯著高于基礎(chǔ)對照組(P<0.01)；與實驗組Ⅰ相比，實驗組Ⅱ的FLuc/RLuc值(0.447±0.103)明顯下降(P<0.01)；pcDNA3.1(+)空載體對照組FLuc/RLuc值(1.484±0.253)顯著高于基礎(chǔ)對照組(P<0.01),FoxO3a質(zhì)粒對照組FLuc/RLuc值(0.213±0.088)與基礎(chǔ)對照組無明顯差異(P>0.05)。

3 討 論

FoxO蛋白是IGF/胰島素信號通路下游一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，人類有4個FoxO同源基因，分別為FoxO1、FoxO2、FoxO3a和FoxO4〔5〕。RT-PCR 及Northern印跡顯示FoxO轉(zhuǎn)錄因子( FoxO1、FoxO3a) 廣泛表達于成人的各組織器官中，包括心、腦等〔4，6〕。近年來，人們對FoxO3a的作用機制研究逐漸從腫瘤細胞轉(zhuǎn)移到了神經(jīng)細胞，發(fā)現(xiàn)其既可在PI3K/AKT通路激活時磷酸化或沉默信息調(diào)節(jié)因子1調(diào)控下去乙?；?，促進神經(jīng)細胞存活、增殖；也可在PI3K/AKT通路受抑制時去磷酸化或P300蛋白調(diào)節(jié)下乙?；T導神經(jīng)細胞凋亡〔7，8〕。本課題前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT/FoxO信號通路參與了PNRP的表達調(diào)控，AKT及FoxO3a蛋白磷酸化的變化可能起到重要作用〔9，10〕。FoxO3a的磷酸化/非磷酸化狀態(tài)與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能有密切關(guān)系。本研究提示，F(xiàn)oxO3a與PRNP的表達存在關(guān)聯(lián)且呈負調(diào)控關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，不同種類的FoxO轉(zhuǎn)錄因子通過識別共有的DNA結(jié)合序列5′-TTGTTTAC-3′結(jié)合到靶基因的啟動子區(qū)域，進而調(diào)控靶基因的表達〔11～13〕。本研究顯示，F(xiàn)oxO3a可能通過結(jié)合PRNP啟動子區(qū)域而抑制其轉(zhuǎn)錄。本研究同時設(shè)置其他幾個組別，用來研究其他因素是否會影響實驗組Ⅰ、Ⅱ的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)并無明顯影響，說明實驗結(jié)果可靠。綜上，F(xiàn)oxO3a可以負調(diào)控PRNP表達，這種調(diào)控是通過結(jié)合PRNP啟動子區(qū)域而抑制其轉(zhuǎn)錄來實現(xiàn)的。但FoxO3a蛋白與PRNP啟動子結(jié)合是直接結(jié)合還是涉及其他中間物質(zhì)有待研究。