濮義福 盧少明

山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院（山東濟(jì)南 250000）

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)影響1%～2%的夫婦，定義為妊娠20 周前連續(xù)流產(chǎn)次數(shù)≥3 次[1]。 關(guān)于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的定義國(guó)內(nèi)外并不完全統(tǒng)一。 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因復(fù)雜，超過(guò)一半的病因仍然無(wú)法解釋[2]。 近期關(guān)于男性因素在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)研究上有一些報(bào)告[3，4]。 如精液常規(guī)分析，但應(yīng)該注意的是，常規(guī)精液分析只顯示有關(guān)精子濃度，運(yùn)動(dòng)和形態(tài)等方面，并沒(méi)有提供有關(guān)精子生育潛力的方面[5]，針對(duì)這一方面， 研究人員研究了男性精子非整倍體率、 精子DNA 碎片和精子染色質(zhì)濃聚等方面，顯然，精子DNA碎片指數(shù)的研究是必要的[6]。 精子DNA 碎片已成為男性不育癥診斷的生物標(biāo)志物，且有不同測(cè)定方法。 因?yàn)楦鱾€(gè)研究間存在一些差異，包括使用不同的檢測(cè)方法、不完全統(tǒng)一的研究對(duì)象、 不同閾值以及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的定義，得出的結(jié)論不相統(tǒng)一，進(jìn)行的meta 分析（異質(zhì)性大，納入的研究為前瞻性研究，納入的研究為為英語(yǔ)發(fā)表的文獻(xiàn)，研究數(shù)量有限）證據(jù)不足，因此有必要進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，探究精子DNA 碎片與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性。

資料和方法

一、文獻(xiàn)檢索

在MEDLINE，EMBASE，Web of Science 和Cochrane 圖書(shū)館數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了搜索， 從建庫(kù)到2019 年7 月10 日， 應(yīng)用以下術(shù) 語(yǔ)：“Sperm DNA integrity”, “The sperm DNA integrity ”, “sperm DNA fragmentation index”, “sperm DNA fragmentation”, “SDF”, “DFI”, “Habitual Abortion”, “Habitual Abortions”, “M iscarriage,Recurrent”, “Recurrent M iscarriage”, “Recurrent M iscarriages”, “Abortion, Recurrent”, “Recurrent Abortion”,“Recurrent Abortions”,“Recurrent Early Pregnancy Loss”,“recurrent spontaneous abortion”。

二、文獻(xiàn)篩選

兩位作者根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)確定并選擇了這些文章。 納入標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）配偶為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)者的不育男性（沒(méi)有其他特殊情況）和研究結(jié)果為精子DNA 碎片/DNA 完整性; 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的定義包括在妊娠早中期（＜24 周）≥2 次或3 次，并且對(duì)照組是配偶無(wú)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)史正常生育能力的男性（沒(méi)有其他特殊情況;捐精者也被考慮符合要求）; （2）有足夠充分的數(shù)據(jù); （3）對(duì)研究類型沒(méi)有限制; （4）精子DNA 碎片指數(shù)的測(cè)定方法為AO，Comet，SCSA，SCD，TUNEL. 排除標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）非復(fù)發(fā)性流產(chǎn)者;（2）研究非精子DNA 碎片。 （3）應(yīng)用其他的測(cè)定方法的；（4）其他語(yǔ)言文獻(xiàn)。

三、資料提取

兩名作者獨(dú)立進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)， 意見(jiàn)不一致時(shí)通過(guò)討論和向?qū)＜易稍兘鉀Q。 如有必要， 聯(lián)系第一作者或相應(yīng)作者以獲取更多信息。

四、質(zhì)量評(píng)價(jià)

根據(jù)紐卡斯?fàn)? 渥太華質(zhì)量評(píng)估量表（NOS）對(duì)該系統(tǒng)綜述中的文獻(xiàn)進(jìn)行嚴(yán)格評(píng)估[7]，此量表為Cochrane工作組推薦的有效工具， 用于評(píng)估非隨機(jī)研究偏倚的風(fēng)險(xiǎn)。 對(duì)于橫斷面研究，使用了改進(jìn)的NOS 量表（由Barry 等人提出）[8]。 根據(jù)NOS 得分， 研究分為低質(zhì)量（0-3 分），中等質(zhì)量（4-6 分）和高質(zhì)量（7-9 分） 。 兩位作者獨(dú)立進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)估。 達(dá)成共識(shí)以解決分歧。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本文前期行meta 分析及已發(fā)表的meta 分析均示異質(zhì)性大，通過(guò)定量的分析具有明顯的偏倚，meta 分析結(jié)果的可靠性較低，遂雖有具體的數(shù)據(jù)，因?yàn)楫愘|(zhì)性大的問(wèn)題，行定性的分析即依據(jù)有效文獻(xiàn)的研究質(zhì)量，通過(guò)對(duì)每篇有效文獻(xiàn)的結(jié)論進(jìn)行總結(jié)， 判斷當(dāng)前的有效文獻(xiàn)結(jié)論是否多數(shù)一致， 因此具體的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法就是通過(guò)定性的方式。

結(jié) 果

一、文獻(xiàn)檢索結(jié)果

檢索過(guò)程見(jiàn)流程圖1。 共搜到242 篇文章。 在基于先前納入標(biāo)準(zhǔn)及題目摘要篩選之后，確定了54 篇文章用于全文篩選。 在進(jìn)一步篩查中，8 篇因涉及到不相關(guān)結(jié)果被排除;6 篇為系統(tǒng)綜述被排除;6 篇為非復(fù)發(fā)性流產(chǎn)被排除;5 篇因非精子DNA 碎片被排除，1 篇因信息不完整被排除。 最終，本綜述納入了28 篇研究，其中中文文獻(xiàn)3 篇，英文文獻(xiàn)25 篇。

圖1 文獻(xiàn)的篩選及納入流程圖

二、納入研究基本特征

提取的信息來(lái)自符合條件的28 篇文獻(xiàn)[9-36]，內(nèi)容包括作者/時(shí)間；研究組與對(duì)照組人數(shù)；研究地點(diǎn)；復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的定義；精子DNA 碎片指數(shù)的測(cè)量方法等。 研究共包括1981 個(gè)參與者， 根據(jù)精子DNA 碎片的測(cè)量方法（Comet，AO，TUNEL，SCSA，SCD）對(duì)研究進(jìn)行分類。詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 納入研究基本特征

三、納入文獻(xiàn)的質(zhì)量評(píng)價(jià)

根據(jù)質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)， 納入的文獻(xiàn)中14 篇為高質(zhì)量，14 篇為中等質(zhì)量， 無(wú)低質(zhì)量研究。 詳細(xì)的內(nèi)容見(jiàn)表2。

表2 納入非隨機(jī)對(duì)照研究的質(zhì)量評(píng)價(jià)表

1.以AO 法測(cè)定精子DNA 碎片

因不同的結(jié)果指標(biāo)、不完全統(tǒng)一的研究對(duì)象、研究設(shè)計(jì)包括方法等的不同，總共四篇定性分析研究。 結(jié)果表明RSA 組與對(duì)照組相比，精子DNA 完整性低，精子DNA 碎片指數(shù)高。 研究（Kazerooni T2009）用AO 方法測(cè)定的精子染色質(zhì)質(zhì)量， 即用精子染色質(zhì)水平代替精子DNA 水平，雖然結(jié)果顯示兩組間沒(méi)有差異，但是從精子DNA 水平結(jié)果是有待進(jìn)一步驗(yàn)證的。 因此，可以認(rèn)為AO 方法的研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，RSA 組患者的精子DNA 碎片指數(shù)更高， 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)與精子DNA 碎片是相關(guān)的。 詳細(xì)信息見(jiàn)表3。

表3 RSA 組與對(duì)照組以AO 法測(cè)定精子DNA 碎片指數(shù)結(jié)論比較

2.以Comet 測(cè)定精子DNA 碎片指數(shù)

定性分析兩篇研究，結(jié)果表明與對(duì)照組相比，RSA組患者的DFI 更高。 因Comet 的測(cè)定方法不統(tǒng)一，研究（Shamsi MB2011）為Grade C and Grade D Comet，而(Ribas-Maynou J2012)用的是Alkaline Comet 和Neutral Comet，但是無(wú)論用何種方式，兩篇研究均得到一致的觀點(diǎn)。 詳細(xì)信息見(jiàn)表4。

3.以TUNEL 法測(cè)定精子DNA 碎片指數(shù)

8 篇研究通過(guò)定性分析， 其中6 篇研究表明，RSA組患者DFI 高于對(duì)照組。 另外兩篇研究（CoughlanC2015）和（CamilleEsquerré-Lamare2018）表明兩組之間沒(méi)有顯著差異。 研究（Coughlan C2015）有一些局限性，最值得注意的是，對(duì)于精子DNA 碎片檢查的精子不是來(lái)自導(dǎo)致受孕的精液， 而是來(lái)自以后為研究目的而產(chǎn)生的標(biāo)本。 因此，精子DNA 碎片指數(shù)可能會(huì)隨著時(shí)間的推移而發(fā)生變化。 此外， 它進(jìn)行了兩次精子DNA 碎片檢測(cè)，且研究中的各組基線特征存在異質(zhì)性，從 而 影 響 結(jié) 果 的 可 信 度。 研 究（CamilleEsquerré-Lamare2018）進(jìn)行了一項(xiàng)多中心前瞻性病例對(duì)照研究，樣本量較小，納入標(biāo)準(zhǔn)較寬，這可能會(huì)導(dǎo)致患者偏倚，且測(cè)量方法為多個(gè)， 在選材及制作樣本的過(guò)程可能還存在選擇偏倚。 因此，兩篇研究的結(jié)果均有待進(jìn)一步驗(yàn)證。總之，目前通過(guò)TUNEL 方法測(cè)定的研究表明，與對(duì)照組相比，RSA 患者的DFI 高。 詳細(xì)信息見(jiàn)表5。

表4 RSA 組與對(duì)照組以Comet 法測(cè)定精子DNA 碎片指數(shù)結(jié)論比較

表5 RSA 組與對(duì)照組以TUNEL 法測(cè)定精子DNA 碎片指數(shù)結(jié)論比較

4.以SCSA 法測(cè)定精子DNA 碎片指數(shù)

9 篇研究通過(guò)定性分析， 其中7 項(xiàng)研究結(jié)果表明，RSA 組患者DFI 高于對(duì)照組。 另外兩項(xiàng)研究（Gil-Villa AM 2010 和Cam illeEsquerré-Lamare2018）表明兩組之間沒(méi)有顯著差異。 研究（Gil-VillaAM 2010）中，兩組年齡有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異， 年齡可能有助于改變精子DNA 碎片。 研究（Cam illeEsquerré-Lamare2018）理由同上三（TUNEL）。 總之，SCSA 測(cè)定的研究表明，與對(duì)照組相比，RSA 患者的DFI 高于對(duì)照組。 詳細(xì)信息見(jiàn)表6。

5.以SCD 法測(cè)定精子DNA 碎片指數(shù)

9 篇研究通過(guò)定性分析，其中8 篇研究表明，與對(duì)照 組 相 比，RSA 組 患 者 的DFI 高。 研 究（CoughlanC2015）理由同上三（TUNEL）。 總之，SCD 測(cè)定的結(jié)果表明DFI 在RSA 組中高。 詳細(xì)信息見(jiàn)表7。

表6 RSA 組與對(duì)照組以SCSA 法測(cè)定精子DNA 碎片指數(shù)結(jié)論比較

表7 RSA 組與對(duì)照組以SCD 法測(cè)定精子DNA 碎片指數(shù)結(jié)論比較

討 論

在這篇系統(tǒng)評(píng)價(jià)中，有4 篇研究(Kazerooni T2009、Gil-Villa AM 2010、CoughlanC2015、Camille Esquerré-Lamare2018） 報(bào)告兩組在精子DNA 碎片方面沒(méi)有差異，其他研究均支持RSA 組的精子DFI%增加或DNA完整性%降低。研究（Kazerooni T2009）用AO 方法測(cè)定的精子染色質(zhì)質(zhì)量， 即用精子染色質(zhì)水平代替精子DNA 水平，雖然結(jié)果顯示兩組間沒(méi)有差異，但是從精子DNA 水平結(jié)果是有待進(jìn)一步驗(yàn)證的。 研究（Gil-VillaAM 2010）中，兩組年齡有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，隨者年齡變化精子DNA 碎片指數(shù)也是變化的。 研究（Coughlan C2015）是存在明顯的局限性，尤其是對(duì)于精子DNA 碎片檢查的精子不是來(lái)自導(dǎo)致受孕的精液， 而是來(lái)自以后為研究目的而產(chǎn)生的標(biāo)本。 因此，精子DNA 碎片指數(shù)可能會(huì)隨著時(shí)間的推移而發(fā)生變化。 此外，它進(jìn)行了兩次精子DNA 碎片檢測(cè)，且研究中的各組基線特征存在異質(zhì)性，從而影響結(jié)果的可信度。 研究（Camille Esquerré-Lamare2018）進(jìn)行了一項(xiàng)多中心前瞻性病例對(duì)照研究，樣本量較小，納入標(biāo)準(zhǔn)較寬，這可能會(huì)導(dǎo)致患者偏倚，且測(cè)量方法為多個(gè)，在選材及制作樣本的過(guò)程可能還存在選擇偏倚。 納入的所有有效文獻(xiàn)的匯總分析與各個(gè)具體方法（Acridine orange test（AO）、Comet assay（Comet）、Sperm Chromatin Structure assay （SCSA）、Sperm Chromatin Dispersion （SCD）、The term inal deoxyuridine nick labeling assay（TUNEL））得出的結(jié)論是一致的，均支持復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者配偶精子DNA 碎片指數(shù)是高于配偶無(wú)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)史的正常生育男性。

對(duì)RPL 夫婦， 精子DNA 碎片增加的具體機(jī)制尚不明確。多數(shù)認(rèn)為與氧化應(yīng)激、精索靜脈曲張、年齡[37]等方面有關(guān)。 現(xiàn)在多數(shù)研究表明氧化應(yīng)激（ROS）是精子DNA 碎片產(chǎn)生的主要原因[38-39]。 值得注意的是，生理?xiàng)l件下精子需要少量的ROS 來(lái)調(diào)節(jié)正常功能，包括精子活力， 頂體反應(yīng)和受精。 ROS 和抗氧化劑之間的平衡對(duì)于防止過(guò)量的ROS 產(chǎn)生至關(guān)重要[40]。因此，DFI，ROS水平可被視為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)治療中的有價(jià)值參數(shù)。 另一方面， 有證據(jù)表明含有DNA 碎片的精子可以存活，運(yùn)動(dòng)，并具有正常的形態(tài)，甚至可以使卵母細(xì)胞受精。 精子DNA 損傷如果不修復(fù)，就會(huì)導(dǎo)致生育能力下降。 但是，卵母細(xì)胞能夠修復(fù)精子DNA，其程度取決于卵母細(xì)胞的質(zhì)量和精子DNA 損傷的程度，未能修復(fù)就會(huì)導(dǎo)致多種問(wèn)題，包括復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[41-42]。 迄今為止，一些研究證實(shí)， 抗氧化治療可能是提高精子參數(shù)和提高精子DNA質(zhì)量的有效方法[43]。抗氧化治療可能有助于有復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病史的夫婦。 目前的指南并不建議男性伴侶精子DNA 碎片的常規(guī)診斷篩查。在RSA 夫婦中男性因素研究較少，局限于染色體核型，精子功能的評(píng)估在很大程度上被忽視[44]。 此外，關(guān)于精子DNA 碎片指數(shù)的測(cè)定方法，基于不同的原理，不同的過(guò)程，值得注意的是SCSA 與AO 雖然是基于相同的原理， 但是檢測(cè)精子DNA碎片的過(guò)程是不一致的，如檢測(cè)的精子數(shù)；新鮮精子或冷凍精子；手動(dòng)計(jì)數(shù)或流式細(xì)胞及計(jì)算機(jī)輔助計(jì)數(shù)；光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡等。 因此將其列為兩種測(cè)定方法。

本文的優(yōu)缺點(diǎn)在于本文前期行meta 分析及已發(fā)表的meta 分析[45-46]均示異質(zhì)性大，通過(guò)定量的分析具有明顯的偏倚， 因此meta 分析結(jié)果的循證證據(jù)等級(jí)有待進(jìn)一步驗(yàn)證，遂雖有具體的數(shù)據(jù)，因?yàn)楫愘|(zhì)性大的問(wèn)題，行定性的分析即依據(jù)有效文獻(xiàn)的研究質(zhì)量，通過(guò)對(duì)每篇有效文獻(xiàn)的結(jié)論進(jìn)行總結(jié)，陽(yáng)性表示納入的有效文獻(xiàn)支持復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者配偶精子DNA 碎片指數(shù)是高于配偶無(wú)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)史的正常生育男性，陰性則持復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者配偶精子DNA 碎片指數(shù)與配偶無(wú)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)史的正常生育男性無(wú)差異的觀點(diǎn)，判斷當(dāng)前的有效文獻(xiàn)結(jié)論是否多數(shù)一致，若結(jié)論為陰性則根據(jù)納入研究文獻(xiàn)的質(zhì)量及結(jié)論進(jìn)行分析，尋找到得出不同結(jié)論的原因，（在本文中有4 篇研究報(bào)告兩組沒(méi)有差異，解釋同上），進(jìn)一步驗(yàn)證分析每個(gè)研究結(jié)論的可靠性， 針對(duì)評(píng)分低的文獻(xiàn)，對(duì)其結(jié)論也持謹(jǐn)慎的態(tài)度，綜合所有的有效文獻(xiàn)，得出偏倚相對(duì)較小的正確結(jié)論，所以說(shuō)我們得出的結(jié)論是更加可靠的。 此外，兩篇meta 分析[45-46]納入前瞻性英文文獻(xiàn)，定量分析兩組精子DNA 碎片指數(shù)情況，通過(guò)分亞組，異質(zhì)性依舊很大，雖然結(jié)論相對(duì)統(tǒng)一，但納入文獻(xiàn)有限，截止日期為2018 年10 月份。此系統(tǒng)評(píng)價(jià)，截止日期2019 年7 月10 日，更加全面、合理及說(shuō)服力。

雖然復(fù)發(fā)性流產(chǎn)與女性有很大的相關(guān)性， 但男性伴侶可能在某些復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病例中發(fā)揮重大作用。 因此，在未來(lái)的研究中，將精子DNA 碎片檢查納入復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的常規(guī)檢查中， 以期進(jìn)行相應(yīng)治療來(lái)改善精子DNA，達(dá)到成功受孕的目的。