賴盈盈，周鮮嬌

（嶺南師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江 524048）

葛根（Puerarin）屬豆科植物野葛的塊根，是國家衛(wèi)生部認(rèn)定的兼具藥用與食用的植物[1]，主要成分為淀粉，含有必需氨基酸和微量元素，還含有葛根素、異黃酮和大豆苷元等多種益生元素，可改善心血管循環(huán)，降低血糖和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等[2-6]，因而各種葛根功能產(chǎn)品（葛根面條、葛根蛋糕、葛根豆腐、葛根口服液和葛根酸奶）應(yīng)運(yùn)而生[7]。酸奶營養(yǎng)豐富，益生菌含量多，易被人體吸收，能有效調(diào)節(jié)人體腸道微生物菌群[8-10]。單純的原味酸奶具有口感單一和益生功能少等特點(diǎn)，因而添加了糧食和果蔬等含糖量低、脂肪含量低、熱量低的多口感多益生功能型酸奶必將成為國內(nèi)外酸奶市場消費(fèi)的主導(dǎo)[11-13]。在葛根酸奶制作方面，張雁等[14]制作葛根酸奶采用新鮮葛根為材料，經(jīng)一系列操作后過濾得葛根汁，不僅操作繁瑣，過濾過程中也會導(dǎo)致葛根營養(yǎng)物質(zhì)流失，利用率降低；冷桂華等[15]制作葛根酸奶時除了護(hù)色劑以及穩(wěn)定劑外，還用多種酶對新鮮葛根進(jìn)行處理，不僅操作過程繁瑣，還添加了過多的物質(zhì)，本實(shí)驗采用葛根粉為原料，在制作過程中直接加入，不需要過多步驟，簡單易操作。

本實(shí)驗以易獲得的葛根粉作為原材料，通過單因素試驗及響應(yīng)面法探索葛根酸奶的制作工藝，并檢測其理化和微生物指標(biāo)以及抗氧化性。旨在為葛根酸奶的市場化供應(yīng)提供科學(xué)的理論依據(jù)，并且為家庭自制葛根酸奶提供科學(xué)的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根粉：購于江西撫州農(nóng)家；德運(yùn)全脂奶粉和白砂糖：市售；川秀乳酸菌酸奶發(fā)酵粉（保加利亞乳桿菌（Lactobacillusbulgaricus）∶嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）（1∶1）：市售。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：美國Sigma公司；鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉、30%過氧化氫、七水合硫酸亞鐵、無水乙醇、水楊酸（均為分析純）：南寧西隴化工有限公司。

MRS肉湯培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基、煌綠乳糖膽鹽培養(yǎng)基：北京奧博星制造生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱、HHS-21-4W型電熱恒溫水浴鍋、YXQ-LS-18SI型手提式壓力蒸汽滅菌器、SW-CJ-2FD型潔凈工作臺：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SQP型電子分析天平：賽多利斯科學(xué)有限公司；BCD-402WDBA型海爾冰箱：青島海爾股份有限公司；V-1800型可見分光光度計：翱藝儀器（上海）有限公司；WYT糖度計：成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司；LL550型離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葛根酸奶制作工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：葛根粉加少量冷水溶解，加入熱水，煮沸至透明成糊狀；全脂奶粉與白砂糖加少量溫水溶解后，加入葛根液后充分?jǐn)嚢瑁粚⒏鸶桃河?00 ℃殺菌并均質(zhì)8 min，冷卻至室溫，得無菌葛根奶液；菌粉用少量無菌水溶解，待葛根奶液冷卻后加入；將接種后的無菌葛根奶液置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h至完全凝固，于4 ℃冰箱冷藏24 h進(jìn)行后熟得到葛根酸奶。

1.3.2 單因素試驗設(shè)計

單因素設(shè)置5個變量：奶粉添加量4%、6%、8%、10%、12%、白砂糖添加量4%、6%、8%、10%、12%、葛根粉添加量1%、2%、3%、4%、5%、發(fā)酵溫度40 ℃、41 ℃、42 ℃、43 ℃、44 ℃、發(fā)酵時間3 h、4 h、5 h、6 h、7 h，以感官評分為評價指標(biāo)，選出最優(yōu)的工藝參數(shù)。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，通過Plackett-Burman（PB）試驗和最陡爬坡試驗確定葛根粉添加量、全脂奶粉添加量和發(fā)酵時間3個較為重要的影響因子為試驗因素，利用Design-ExpertV.10對響應(yīng)面試驗進(jìn)行設(shè)計。葛根酸奶感官評分為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到葛根酸奶3個顯著因素交互作用的等高線圖和響應(yīng)面，并根據(jù)對等高線及響應(yīng)面的分析進(jìn)行試驗優(yōu)化。Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests design

1.3.4 酸奶品質(zhì)分析

（1）感官評定

隨機(jī)選取10位同學(xué)組成評價小組對葛根酸奶進(jìn)行感官評分，參照GB/T 19302—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》[16]，從組織形態(tài)、口感、風(fēng)味對葛根酸奶進(jìn)行評分，滿分100分。以感官評分平均值為評價指標(biāo)，評分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表2 葛根酸奶感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standard of Pueraria yogurt

（2）理化指標(biāo)及微生物指標(biāo)檢測

酸度：按照GB 5413.34—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)乳和乳制品酸度的測定》[17]中的方法測定。

糖度：酸奶于離心機(jī)4 500 r/min離心10 min，取上清液，并用糖度計測量自制葛根酸奶與市售酸奶的糖度。

乳酸菌數(shù)：按照GB/T 4789.35—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)乳酸菌檢驗》[18]中的方法測定。

大腸桿菌：按照GB/T 4789.3—2008《食品衛(wèi)生生物學(xué)檢驗大腸桿菌計數(shù)》[19]中的方法測定。

1.3.5 酸奶抗氧化性測定

（1）DPPH自由基清除率測定

酸奶于離心機(jī)4 500 r/min離心10 min，取上清液備用。參考張玉坤[20]的方法測定葛根酸奶對DPPH自由基的抗氧化性，以維生素C（vitamin C，VC）作為陽性對照。

（2）羥自由基清除率測定

酸奶于離心機(jī)4 500 r/min離心10 min，取上清液備用。參考王臨賓[21]的方法測定葛根酸奶對羥自由基的抗氧化性，以2 mg/L的VC作為陽性對照。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010進(jìn)行單因素試驗的繪圖；運(yùn)用Design-Expert 10.0.3進(jìn)行PB試驗、響應(yīng)面試驗設(shè)計、結(jié)果和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 葛根粉添加量的確定

葛根粉添加量對酸奶品質(zhì)的影響見圖1。由圖1可知，葛根酸奶感官評分隨葛根粉的添加量在1%～5%范圍內(nèi)的增加先上升后下降，原味酸奶風(fēng)味偏淡，葛根粉添加量1%時葛根味道不明顯；添加4%時葛根獨(dú)特香味、凝乳好、具濃郁的酸奶風(fēng)味，葛根粉添加量5%時酸奶較粗糙，過于黏稠。因此，添加4%的葛根粉時評分最佳。

圖1 葛根粉添加量對酸奶感官品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of Pueraria powder addition on yogurt sensory quality

2.1.2 奶粉添加量的確定

奶粉添加量對酸奶品質(zhì)的影響見圖2，由圖2可知，葛根酸奶感官評分隨奶粉添加量在4%～12%范圍內(nèi)的增加先上升后下降，奶粉添加量＜8%時，酸奶風(fēng)味不濃郁，凝乳不均勻；奶粉添加量為8%時，酸奶味濃郁，具有葛根清香，粘稠適中，凝乳均勻，口感細(xì)膩，感官評分為86；奶粉添加量＞8%時，酸奶過于黏稠，口感粗糙。因此，添加8%奶粉時感官最佳。

圖2 奶粉添加量對酸奶感官品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of milk powder addition on yogurt sensory quality

2.1.3 白砂糖添加量的確定

圖3 白砂糖添加量對酸奶感官品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of sugar addition on yogurt sensory quality

白砂糖添加量對酸奶品質(zhì)的影響見圖3。由圖3可知，葛根酸奶感官評分隨白砂糖添加量在4%～12%范圍內(nèi)的增加先上升后下降。葛根粉添加量為6%時，酸奶黏稠度恰好，酸奶味濃郁且具有葛根清香，酸甜度適中；添加量低于6%，酸奶味道不濃郁，甜味不明顯；添加量增至8%時，酸奶過甜，稠厚感差。因此，6%的白砂糖添加量最為合適。

2.1.4 發(fā)酵溫度的確定

發(fā)酵溫度對酸奶品質(zhì)的影響見圖4。由圖4可知，葛根酸奶感官評分隨發(fā)酵溫度的增加先升高后降低。高于42 ℃時，酸奶口感潤滑度下降，部分產(chǎn)生少量乳清；溫度為42 ℃時，酸奶口感最佳；低于42 ℃時，葛根酸奶，凝乳不均勻，酸奶風(fēng)味不濃郁。因此，最佳發(fā)酵溫度為42 ℃。

圖4 發(fā)酵溫度對酸奶感官品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on yogurt sensory quality

2.1.5 發(fā)酵時間的確定

發(fā)酵時間對酸奶品質(zhì)的影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，葛根酸奶感官評分隨發(fā)酵時間的增加先上升后下降，高于5 h時，酸奶過于黏稠，部分產(chǎn)生少量乳清；時間為5 h時，酸奶口感細(xì)膩，酸甜適中；發(fā)酵時間低于5 h時，酸奶過稀。因此，最佳發(fā)酵時間為5 h。

圖5 發(fā)酵時間對酸奶感官品質(zhì)的影響Fig.5 Effect of fermentation time on yogurt sensory quality

2.2 Plackett-Burman試驗設(shè)計

Plackett-Burman試驗是指在較少的試驗次數(shù)下，從多因素試驗中篩選出影響比較顯著的因素[22]。表3為PB試驗設(shè)計以及感官評分結(jié)果，以感官評分（Y）為響應(yīng)值得出的響應(yīng)面結(jié)果如表4。對表4進(jìn)行分析可以得出，模型P=0.039 3＜0.05，具顯著性，說明模型在統(tǒng)計學(xué)上有意義。5個因素中，對葛根酸奶品質(zhì)的影響為奶粉添加量＞發(fā)酵時間＞葛根粉添加量＞發(fā)酵溫度＞白砂糖添加量。由系數(shù)估值可知，A、C、D、E為正效應(yīng)，B為負(fù)效應(yīng)。結(jié)合各因素P值以及正負(fù)效應(yīng)，選擇葛根粉添加量、奶粉添加量和發(fā)酵時間這3個顯著性較強(qiáng)的因子進(jìn)行最陡爬坡試驗。

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計Table 3 Design of Plackett-Burman tests

表4 Plackett-Burman試驗結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of Plackett-Burman tests

2.3 最陡爬坡試驗

表5 最陡爬坡試驗結(jié)果Table 5 Results of the steepest climbing tests

由各因素的P值可得影響較大的因素為：奶粉添加量、發(fā)酵時間和葛根粉添加量；正負(fù)效應(yīng)影響爬坡的方向和步長；由系數(shù)估值可得，葛根粉添加量和發(fā)酵時間為正效應(yīng)，奶粉添加量為負(fù)效應(yīng)。設(shè)置五個試驗進(jìn)行感官評分。由表5可知，感官評分最高的是試驗號1，為88分。所以以葛根粉添加量4%、奶粉添加量8%、發(fā)酵時間5 h為最佳結(jié)果作為Box-Behnken試驗設(shè)計的中心點(diǎn)展開試驗。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在PB試驗和最陡爬坡試驗的基礎(chǔ)上，響應(yīng)面試驗選取的三個因素為：葛根添加量（A）、奶粉添加量（B）以及發(fā)酵時間（E），以感官評分（Y）為響應(yīng)值，利用Design-Expert.V.10軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗設(shè)計，響應(yīng)面試驗分析結(jié)果見表6，方差分析結(jié)果見表7。

表6 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 6 Design and results of response surface tests

表7 響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析Table 7 Variance analysis of response surface tests results

續(xù)表

通過對表6的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行三元二次回歸擬合，得到響應(yīng)面回歸模擬方程：Y=+89.00-2.12A+2.38B+1.25E+3.75AB+0.50AC-0.50BE-4.38A2-8.88B2-6.62E2。從表7可得，該模型的P=0.0003＜0.001，極顯著，則該模型具有統(tǒng)計學(xué)意義；失擬項P=0.0625＞0.05，不顯著；回歸方程決定系數(shù)R2=0.962 4，這都說明二次回歸模型擬合度良好；調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.914 0，說明該模型能解釋91.40%響應(yīng)值的變化，即試驗得出的葛根酸奶發(fā)酵方案可用；變異系數(shù)（coefficientofvariation，CV）%=2.67%，較低，表明該模型的精確度較高。

各因素的交互作用對酸奶感官評分的影響見圖6。如圖6所示，兩兩因素之間對酸奶品質(zhì)影響的響應(yīng)面圖和等高線圖均存在最大值。葛根粉添加量與奶粉添加量的交互作用較強(qiáng)，對葛根酸奶品質(zhì)的影響顯著。葛根粉添加量和發(fā)酵時間、奶粉添加量和發(fā)酵時間兩兩因素的交互作用較弱，但存在最大響應(yīng)值，等高線為圓形，對葛根酸奶品質(zhì)的影響不顯著。

圖6 各因素交互作用對葛根酸奶感官評分的響應(yīng)面圖和等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on sensory score of Pueraria yoghurt

根據(jù)Design-Expert V.10對實(shí)驗的數(shù)據(jù)分析，依據(jù)得出的模型擬合結(jié)果，本實(shí)驗的最佳工藝參數(shù)為：葛根添加量3.801%，奶粉添加量8.179%，發(fā)酵時間5.084 h，感官評分預(yù)測值為89.37分?？紤]到操作的便利性，葛根酸奶發(fā)酵工藝參數(shù)修訂為：葛根粉添加量3.8%，奶粉添加量8.2%，發(fā)酵時間5 h。以最佳發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行驗證試驗，結(jié)果葛根酸奶感官評分的實(shí)際值均值為90分，與預(yù)測值89.37分相差不大，表明該二次回歸模型擬合度較好，也說明了通過響應(yīng)面法可以優(yōu)化葛根酸奶的配方，其回歸方程也能夠有效地對葛根酸奶的配方進(jìn)行分析與預(yù)測。

2.5 葛根酸奶品質(zhì)檢測結(jié)果

2.5.1 感官評價

本實(shí)驗優(yōu)化得出的最佳方案制作的葛根酸奶呈乳白色，組織細(xì)膩，口感佳，酸奶味濃郁且具有葛根清香，酸甜適中，無乳清析出，不存在分層、氣泡，感官評分為90分。

2.5.2 理化與微生物指標(biāo)

最優(yōu)發(fā)酵方案制得的葛根酸奶酸度為72°T；糖度為8.6%，符合現(xiàn)今社會追求的低糖食物風(fēng)尚；乳酸菌數(shù)為1.3×108CFU/mL，大腸桿菌未檢出。以上理化及微生物指標(biāo)檢測結(jié)果均符合相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)。

2.6 葛根酸奶抗氧化性檢測結(jié)果

將葛根酸奶，2 mg/L VC以及原味酸奶對DPPH自由基、羥基自由基清除率進(jìn)行測定，結(jié)果見圖7。由圖7可知，酸奶均具有抗氧化性，但葛根酸奶總體上抗氧化性能強(qiáng)于原味酸奶，但比2 mg/L的VC的抗氧化性能弱。

圖7 不同樣品對DPPH自由基（A）、羥自由基（B）的清除率Fig.7 Scavenging rate of different samples on DPPH (A) and hydroxyl radicals (B)

3 結(jié)論

本次實(shí)驗優(yōu)化的葛根酸奶組織細(xì)膩，口感佳，酸奶味濃郁且具有葛根清香，酸甜適中，無乳清析出，響應(yīng)面優(yōu)化后，感官評分達(dá)到90，與預(yù)測值相近。葛根酸奶的酸度為72°T，糖度為8.6%，乳酸菌數(shù)為1.3×108CFU/mL，大腸桿菌未檢出。以上檢測結(jié)果均符合各項相對應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)；葛根酸奶清除DPPH自由基以及羥自由基的能力高于自制原味酸奶，由此說明葛根酸奶是一種值得開發(fā)的益生乳品。