王 威，王 婧，石洪爽，武 昕

0 引 言

外陰硬化性苔蘚(vulvar lichen sclerosis，VLS)是婦科常見(jiàn)的一種慢性炎癥性皮膚病。主要表現(xiàn)為女性外陰瘙癢、皮膚色素脫失、萎縮，嚴(yán)重者出現(xiàn)尿道口和陰道口狹窄，具有典型的組織病理學(xué)改變，惡變率為2%～4%[1]。目前病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，可能與遺傳，自身免疫和氧化應(yīng)激有關(guān)[2]，無(wú)較好的治療方法。因此，探討發(fā)病機(jī)制是臨床上亟待解決的問(wèn)題。VLS典型的病理改變是真皮淺層呈均質(zhì)帶改變，主要是變性的膠原纖維蛋白。因此，膠原蛋白的代謝異常與VLS的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。膠原蛋白主要來(lái)源于成纖維細(xì)胞，成纖維細(xì)胞在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)作用下，可分泌膠原蛋白(Col)I、III，彈力蛋白，MMPs和蛋白多糖等細(xì)胞外基質(zhì)等[3-5]。皮膚中I、III型膠原蛋白是構(gòu)成皮膚真皮細(xì)胞外基質(zhì)最主要的蛋白成分，具有保持皮膚水分、支撐皮膚正常結(jié)構(gòu)及維持皮膚韌性的功能，主要分布于真皮層，僅由成纖維細(xì)胞合成和分泌[6]。目前尚不清楚VLS形成過(guò)程中成纖維細(xì)胞及I、III型膠原蛋白的變化。因此，本研究擬探討VLS中成纖維細(xì)胞及TGF-β和膠原蛋白I、III mRNA的變化，分析其與VLS發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料選取2016年9月至2018年6月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科手術(shù)切除或活檢的30份外陰硬化性苔蘚標(biāo)本。VLS早期和進(jìn)展期各15份，外陰正常皮膚(外陰整形手術(shù)切除的正常皮膚)15份。10%甲醛固定，-80 ℃冰箱保存。

1.2 主要試劑Vimentin兔抗人單克隆抗體和S-P超敏試劑盒(福州邁新生物技術(shù)有限公司)；mRNAeasy Mini Kit試劑盒(德國(guó)，Qiagen公司)；β-actin、I型膠原、III型膠原、TGF-β1和TGF-β2引物(美國(guó)Invitrogen公司)；A5001反轉(zhuǎn)錄試劑盒及A6001 Real Time PCR試劑盒(美國(guó)Promega公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組化檢測(cè)石蠟切片逐步脫蠟至水，H2O2 混合液室溫下5～10 min滅活內(nèi)源性酶，抗原熱修復(fù)后加一抗(Vimentin 1∶100) ，4 ℃過(guò)夜；生物素化山羊抗小鼠/兔IgG，室溫下孵育15 min；鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物，室溫下孵育15 min；滴加新配置的DAB溶液，顯微鏡下顯色，自來(lái)水沖洗終止；蘇木精復(fù)染，封固。

1.3.2 實(shí)時(shí)定量PCR分析(Real-time)①總RNA的提取(使用Qiagen公司的Rneasy mini kit試劑盒抽提全部45例標(biāo)本組織RNA，操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，RNA樣品存于-80 ℃冰箱);②RNA的逆轉(zhuǎn)錄(按照promega A5001試劑說(shuō)明書(shū)操作，得到cDNA存于-20 ℃冰箱);③Real-time PCR (按照promega A6001試劑說(shuō)明書(shū)操作)。引物設(shè)計(jì)：β-actin由Invitrogen公司設(shè)計(jì)，I型膠原及TGF-β1由文獻(xiàn)中查找，III型膠原及TGF-β2由PRIMER BANK中查找，并經(jīng)過(guò)BLAST及預(yù)實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)，具體引物如下：β-actin序列上游5′-3′：CATTGCCGACAGGATGCA；序列下游5′-3′：CATCTGCTGGAAGGTGGACAG;TGF-β1序列上游5′-3′：CAACAATTCCTGGCGATACC；序列下游5′-3′：GAACCCGTTGATGTCCACTT;TGF-β2序列上游5′-3′：CAGCACACTCGATATGGACCA；序列下游5′-3′：CCTCGGGCTCAGGATAGTCT;Col I序列上游5′-3′：AGGCCCTCAAGGTTTCCAAGG；序列下游5′-3′：CCAGACCATTGTGTCCCCTAA;Col III序列上游5′-3′：GCCAAATATGTGTCTGTGACTCA；序列下游5′-3′：GGGCGAGTAGGAGCAGTTG。配置PCR反應(yīng)混合液18 μL(組分：Nuclease-Free Water 7 μL；上游引物(10 μmol/L)0.4 μL；下游引物(10 μmol/L)0.4 μL；qPCR Master Mix，2X 10 μL；CXR100X 0.2 μL)，并分至各反應(yīng)管，然后加入2 μL模板反應(yīng)體系加入光學(xué)96孔板，加蓋光學(xué)封口膜，離心后放入ABI 7900 HT熒光定量PCR儀，PCR反應(yīng)條件為:95 ℃ 2 min, 95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,40 循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 免疫組化結(jié)果判定應(yīng)用MetaMorph顯微圖像分析系統(tǒng)對(duì)Vimentin進(jìn)行積分光密度測(cè)定，鏡下選取真皮層，以均質(zhì)帶的下緣為標(biāo)記，分出淺層(包括均質(zhì)帶)和深層，每張切片分別在淺層和深層隨機(jī)選取病變區(qū)域內(nèi)的5個(gè)高倍視野，計(jì)算其平均積分光密度值。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果判定完成 Real-time PCR 后對(duì)其溶解曲線進(jìn)行分析并結(jié)合瓊脂糖分析PCR產(chǎn)物是否特異。分析PCR反應(yīng)曲線，所得出的數(shù)據(jù)按2-ΔΔCT法計(jì)算出基因表達(dá)的相對(duì)量。

2 結(jié) 果

2.1 Vimentin在外陰正常皮膚和VLS中表達(dá)Vimentin蛋白陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞質(zhì),呈棕黃褐色。Vimentin陽(yáng)性細(xì)胞分布在外陰正常皮膚的真皮全層。見(jiàn)圖1a。VLS平均光密度值(129.3±59.78)較正常皮膚(47.04±5.31)明顯增大(P<0.05)；早期VLS中Vimentin陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在真皮淺層，見(jiàn)圖1b。進(jìn)展期VLS中Vimentin陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在真皮深層,見(jiàn)圖1c。早期VLS平均光密度值(136.9±43.02)與進(jìn)展期VLS(127.9±19.41)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TGF-β1、TGF-β2、Col I和Col III mRNA結(jié)果VLS中TGF-β1mRNA表達(dá)較正常皮膚明顯增加(P<0.05)。VLS進(jìn)展期TGF-β1mRNA明顯高于VLS早期(P<0.05)。VLS及VLS早期中Col I mRNA表達(dá)量較正常皮膚明顯增加(P<0.05)。VLS 中Col I/III比值較正常皮膚明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)表1。

a: 正常皮膚;b: VLS真皮淺層;c: VLS真皮深層

圖1 Vimentin陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)(s-p法 ×200)

Figure 1 Expression of Vimentin positive cells (s-p method ×200)

分類(lèi)TGF-β1mRNATGF-β2mRNACol ImRNA Col IIImRNACol I/III正常皮膚1.72±1.001.66±1.421.16±0.442.75±2.991.35±0.70VLS110.68±56.34?3.86±2.524.63±1.47?3.40±1.163.18±0.98?VLS早期6.37±3.031.35±1.083.34±1.81?2.31±1.311.09±0.44VLS進(jìn)展期104.31±57.29#3.51±2.871.29±0.941.09±1.032.09±1.10

與正常皮膚比較，*P<0.05;與VLS早期比較，#P<0.05

3 討 論

目前病理學(xué)上將外陰硬化性苔蘚分為早期和進(jìn)展期2種類(lèi)型。早期鏡下可見(jiàn)棘層細(xì)胞輕度不規(guī)則的增厚，真皮淺層水腫，大量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),無(wú)明顯的均質(zhì)帶；進(jìn)展期可見(jiàn)表皮角質(zhì)層增厚，棘層細(xì)胞減少，基底細(xì)胞液化，真皮淺層膠原纖維變性形成均質(zhì)帶，其下伴大量的淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)[7]。2種病理改變是否存在一個(gè)演變的過(guò)程，形成機(jī)制是否相同，尚不清楚。成纖維細(xì)胞是皮膚真皮層中主要的細(xì)胞，它可以產(chǎn)生大量的膠原蛋白、彈性纖維蛋白及多種細(xì)胞修復(fù)因子，并可通過(guò)血液系統(tǒng)進(jìn)入全身各系統(tǒng)，具有強(qiáng)大的自我更新能力[8]。

本研究首先檢測(cè)Vimentin標(biāo)記的成纖維細(xì)胞在外陰硬化性苔蘚中的分布。結(jié)果顯示：外陰硬化性苔蘚中成纖維細(xì)胞明顯增加，早期主要分布在病變的真皮淺層，進(jìn)展期主要分布在病變的真皮深層。提示真皮層中成纖維細(xì)胞增多與外陰硬化性苔蘚的形成有關(guān)。TGF-β是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，TGF-β1的釋放和活化促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，刺激包括膠原蛋白在內(nèi)的多種細(xì)胞外基質(zhì)沉積[9-11]。TGF-β被認(rèn)為是最為關(guān)鍵的致纖維化因子，TGF-β1是與器官纖維化關(guān)系最密切的亞型[12]。外陰硬化性苔蘚與腎、肺、心肌等纖維化疾病具有相似的發(fā)病機(jī)制。TGF-β1的下游效應(yīng)因子CTGF參與這一過(guò)程，它可以促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂和膠原合成，增加細(xì)胞的粘附和趨化作用。在一些纖維化疾病中TGF-β1和CTGF表達(dá)同時(shí)增加[13]，進(jìn)一步闡明TGF-β1促進(jìn)膠原蛋白合成的機(jī)制。本研究中還檢測(cè)TGF-β1mRNA 在外陰硬化性苔蘚中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β1mRNA在早期及進(jìn)展期表達(dá)量增多，進(jìn)展期升高明顯。提示TGF-β1在外陰硬化性苔蘚的形成和發(fā)展中起重要作用。另外，由于TGF-β2與TGF-β1具有同樣的促進(jìn)組織纖維化作用，本研究又檢測(cè)了TGF-β2mRNA在外陰硬化性苔蘚中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β2mRNA僅在進(jìn)展期略有增加，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步說(shuō)明在外陰硬化性苔蘚中促進(jìn)膠原合成的細(xì)胞因子主要是TGF-β1。

Orlando報(bào)道在TGF-β1刺激下I型膠原蛋白合成增加，同時(shí)通過(guò)膠原酶抑制III型膠原蛋白的合成，I/III型膠原蛋白的比例增加[14]。本研究中I型膠原蛋白mRNA在VLS早期表達(dá)升高，進(jìn)展期略有下降，III膠原蛋白mRNA從早期到進(jìn)展期逐漸下降，I/III膠原蛋白mRNA比值增加，提示在TGF-β1作用下外陰硬化性苔蘚中I型膠原增加，III型膠原蛋白逐漸減少。膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分約占膠原纖維固體物85%，在皮膚中主要是 I、III型膠原蛋白，I 型膠原蛋白占膠原總量80%～85%，III型膠原蛋白占膠原總量的15% ～20%[15]。I型膠原起支架作用，III型膠原決定膠原纖維的直徑大小和彈性。從結(jié)構(gòu)上看，I型膠原是主體，III型膠原包繞于外周，III型膠原比例決定膠原纖維的直徑大小及彈性好壞，III型膠原含量越高，膠原纖維越細(xì)，彈性越好[16]。本研究發(fā)現(xiàn)在外陰硬化性苔蘚病變中III型膠原mRNA的含量從早期到進(jìn)展期是逐漸下降，與臨床上患者病變皮膚彈性減弱，容易皸裂有關(guān)。如何提高III型膠原的比例，緩解癥狀仍是我們需要解決的課題。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)VLS真皮層內(nèi)成纖維細(xì)胞和TGF-β1增加，促進(jìn)Col I的合成，減少Col III的含量，可能是導(dǎo)致VLS皮膚彈性減低的因素之一。