張文慧，高 麗，朱曉佳，王羽維，高倩雯，肖鈺潔，李 偉，陳 龍

0 引 言

伊伐布雷定是全球第一個(gè)If電流抑制劑，If電流是超級(jí)化緩慢激活的內(nèi)向鈉、外向鉀混合內(nèi)向的離子流，在-110到-100 mV被激活，翻轉(zhuǎn)電位在-10到-20 mV，受cAMP (Cyclic Adenosine monophosphate)調(diào)控[1]。主要用于治療射血分?jǐn)?shù)降低的慢性心力衰竭患者，特別是對(duì)于β腎上腺素受體阻斷劑或者鈣通道受體阻斷劑不能耐受或存在禁忌的心絞痛患者[2]。2005年歐洲藥監(jiān)局批準(zhǔn)了伊伐布雷定的上市，2015年美國(guó)FDA批準(zhǔn)了伊伐布雷定用于慢性心衰的治療[3]。我國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局于2015年4月批準(zhǔn)伊伐布雷定用于心衰的治療，以減少心力衰竭惡化而住院的風(fēng)險(xiǎn)[4]。

有報(bào)道指出伊伐布雷定治療穩(wěn)定性心絞痛及心肌缺血完全依賴于對(duì)If電流的抑制作用[5]。也有報(bào)道稱伊伐布雷定的作用機(jī)制涉及多方面，包括對(duì)血管及心臟結(jié)構(gòu)及功能的影響[6]。長(zhǎng)期使用伊伐布雷定可增加心力衰竭大鼠的心臟收縮力，改善db/db心衰小鼠左心室收縮力及增加受磷蛋白磷酸化[7-8]。臨床試驗(yàn)表明伊伐布雷定對(duì)動(dòng)脈血壓的作用呈現(xiàn)出不一致的結(jié)果，增加、降低或無作用[9]；也有文獻(xiàn)報(bào)道伊伐布雷定具有明確增加動(dòng)脈血壓作用[10]。

基于文獻(xiàn)報(bào)道的伊伐布雷定正性肌力作用，本研究首次采用雙壓力導(dǎo)管分析伊伐布雷定心臟收縮力及血壓的作用，并分析其心輸出量。為了證明伊伐布雷定對(duì)體內(nèi)大鼠的正性肌力作用是獨(dú)立于神經(jīng)體液，體外大鼠心臟灌流實(shí)驗(yàn)被用于分析伊伐布雷定對(duì)心臟的直接作用，且體外心臟固定頻率刺激模式(4 Hz)被用于排除頻率對(duì)左心室收縮力的影響。利用體外心臟灌流化合物濃度可控的優(yōu)點(diǎn)，采用與心臟收縮力直接相關(guān)3種酶的抑制劑PKA抑制劑H89, CaMKII抑制劑KN-93, PP1、PP2A抑制劑Calyculin A，分析伊伐布雷定正性肌力作用的可能靶點(diǎn)。體外心臟實(shí)驗(yàn)及鈣釋放實(shí)驗(yàn)不僅進(jìn)一步證實(shí)其正性肌力作用，并進(jìn)行了其作用機(jī)制探討。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑伊伐布雷定購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；PKA抑制劑H89及CaMKII抑制劑KN-93購(gòu)于Selleck公司；PP1、PP2A抑制劑Calyculin A購(gòu)于Genne Operation公司；熒光染色劑Fluo-4 AM購(gòu)于東仁化學(xué)科技(上海)有限公司；其他試劑均購(gòu)于Sigma公司。

1.2儀器PowerLab 8/35多導(dǎo)生理記錄儀(AD Instruments，澳大利亞)；35-2083 Rev. F Millar放大器、SPR-901 型雙壓力Millar心室內(nèi)壓和壓力容積導(dǎo)管(MILLAR公司，美國(guó))；Olympus IX53倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)；ZYLA-5.5-CL3科研級(jí)高靈敏致冷CCD(ANDOR公司，英國(guó))；Lambda DG-4超高速波長(zhǎng)切換裝置(Sutter，美國(guó))；VC3-8灌流給藥系統(tǒng)(ALA公司，美國(guó))。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SD大鼠，體重250～300 g，購(gòu)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(蘇)2012-0008，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK(蘇)2011-0053。在溫度23℃、相對(duì)濕度60%～70%，12～12 h明暗周期的飼養(yǎng)室自由進(jìn)食和飲水。

1.4濃度計(jì)算按照伊伐布雷定的說明書，最終選擇濃度為1mg/kg 伊伐布雷定進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)文獻(xiàn)[11]，伊伐布雷定對(duì)單個(gè)新生大鼠的心肌細(xì)胞上測(cè)量動(dòng)作電位，所使用的濃度是10 μmol/L，所以我們選擇此濃度。體外實(shí)驗(yàn)H89，KN-93及CA分別選擇為200、500、10 nmol/L，以確保其PKA，CaMKII，PP1及PP2A超過半數(shù)活性被抑制[12-15]。

1.5體內(nèi)大鼠血流動(dòng)力學(xué)分析健康清潔級(jí)雄性SD大鼠，腹腔注射20%烏拉坦(5 mL/kg)麻醉。大鼠全麻后，將其四肢固定于保溫臺(tái)上，分離其體右側(cè)位的頸總動(dòng)脈，動(dòng)脈開口后插入已定標(biāo)的雙壓力Millar導(dǎo)管至大鼠的左心室內(nèi)，手術(shù)線固定。打開Labchart 8軟件，觀察其波形，不斷微調(diào)導(dǎo)管在心室內(nèi)的位置，直到大鼠狀態(tài)穩(wěn)定，環(huán)的位置不變化且呈現(xiàn)規(guī)則的矩形狀[15-16]。大鼠的收縮壓、舒張壓、容積3個(gè)波形都穩(wěn)定時(shí)即停止調(diào)導(dǎo)管位置。待穩(wěn)定后，記錄給藥前各指標(biāo)作為空白對(duì)照?？瞻讓?duì)照記錄結(jié)束后，將伊伐布雷定溶于0.3 mL等滲鹽水經(jīng)大鼠頸靜脈給藥，待藥效穩(wěn)定后記錄大鼠加藥后左心室壓力及容積、心輸出量、心率、動(dòng)脈收縮壓及動(dòng)脈舒張壓。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，自頸靜脈推注30%高滲鹽水20～50 μL及取自身血液進(jìn)行容積定標(biāo)。采用7只大鼠重復(fù)上述實(shí)驗(yàn) (n=7)，以給藥前記錄數(shù)據(jù)為空白A組，給藥后記錄數(shù)據(jù)為給藥A組，比較給藥前后各指標(biāo)變化。

1.6體外大鼠心臟左心室收縮力分析選取雄性SD大鼠進(jìn)行麻醉(方法同體內(nèi)實(shí)驗(yàn))，迅速剪開胸腔，剪取心臟，放置于0 ℃至4 ℃無鈣臺(tái)氏灌流液中使其停搏。將體外大鼠心臟掛于已充滿灌流液的Langendorff裝置上行插管后，在充氧 (95%O2+5%CO2)，溫度為 (37.5±0.5)℃條件下，經(jīng)主動(dòng)脈逆行灌流體外心臟含鈣臺(tái)氏液，灌流壓為90 cm H2O (1 cm H2O=0.098 kPa)。將壓力換能器插管內(nèi)充滿灌流液并排空氣泡，經(jīng)由左心房插入左心室，連接RM6240型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)，記錄左心室收縮曲線。曲線穩(wěn)定后，由刺激器通過一對(duì)刺激電極以5 V的強(qiáng)度加于體外心臟兩側(cè)，刺激心臟以4 Hz固定頻率(即心率240)進(jìn)行跳動(dòng)。記錄加藥前收縮曲線作為空白對(duì)照，隨后更換含一定濃度藥物灌流液，待藥效穩(wěn)定后，記錄收縮曲線，記錄參數(shù)為左心室發(fā)展壓 (left ventricular-developed pressure, LVDP)。灌流液的組成(mmol/L): NaCl 135, Glucose 10, KCl 5.4, HEPES 5, MgCl21, NaH2PO40.33, CaCl21.8, NaOH調(diào)pH至7.3。灌流順序如下：正常灌流液→含1 μmol/L伊伐布雷定灌流液→含10 μmol/L伊伐布雷定灌流液；正常灌流液→含200 nmol/L H89灌流液→含200 nmol/L H89和10 μmol/L伊伐布雷定灌流液；或正常灌流液→含500 nmol/L KN-93灌流液→含500 nmol/L KN-93+10 μmol/L 伊伐布雷定灌流液；或正常灌流液→含10 nmol/L CA灌流液→含10 nmol/L CA+10 μmol/L伊伐布雷定灌流液。實(shí)驗(yàn)中4個(gè)灌流順序均重復(fù)6例。正常灌流液作為空白B組(n=6)，含伊伐布雷定(1, 10 μmol/L)灌流液為給藥B組(n=6)；將正常灌流液設(shè)置為H89、 KN-93及CA對(duì)照組，將H89 (200 nmol/L)、KN-93 (500 nmol/L)、CA (10 nmol/L)分別設(shè)置為H89、KN-93、KN-93處理組，另將伊伐布雷定(10 μmol/L)+H89 (200 nmol/L)、KN-93 (500 nmol/L)、 CA (10 nmol/L處理)分別設(shè)置為伊伐布雷定+ H89 處理組、KN-93處理組、CA 處理組(n=6)。

1.7心肌細(xì)胞鈣釋放測(cè)定雄性SD大鼠麻醉(方法同體內(nèi)實(shí)驗(yàn))后，將體外心臟Langendorff裝置上灌流(方法同體外心臟灌流實(shí)驗(yàn))，用含2 mg/mL CollagenaseⅡ及0.1 mg/mL胰蛋白酶消化大約30 min。剪取心臟于無鈣臺(tái)氏灌流液中充分剪碎，過濾，得到細(xì)胞懸液，靜置后用無鈣臺(tái)氏灌流液反復(fù)沖洗2次。隨后去除細(xì)胞外的無鈣臺(tái)氏液分別加入0.25、0.5、1 mmol/L鈣離子的臺(tái)式液進(jìn)行梯度復(fù)鈣，每個(gè)梯度濃度復(fù)鈣時(shí)間為10 min。待復(fù)鈣完成后，取出1 mL含適量心肌細(xì)胞懸液加入鈣熒光指示劑Fluo-4 AM，使細(xì)胞懸液中Fluo-4 AM (5 μmol/L)，于37 ℃避光孵育30 min。孵育熒光劑完成的心肌細(xì)胞再?gòu)?fù)鈣，用含鈣(1 mmol/L)臺(tái)氏液清洗2～3次后備用。在倒置顯微鏡的灌流槽中滴加染有熒光劑的細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后，替換細(xì)胞外液體為含鈣 (1.8 mmol/L)臺(tái)氏液。由刺激器通過一對(duì)刺激電極以1 Hz，15 V的強(qiáng)度加于心肌細(xì)胞兩側(cè)，刺激細(xì)胞收縮。選取長(zhǎng)桿狀，橫紋清晰，折光度好，熒光度強(qiáng)的細(xì)胞。單色激發(fā)光源發(fā)出激發(fā)光，通過耦合系統(tǒng)引入熒光顯微鏡，并聚焦到細(xì)胞表面，激發(fā)細(xì)胞中的熒光探針Fluo-4 AM發(fā)出熒光，采用空氣冷卻CCD相機(jī)采集并記錄熒光信號(hào)[17]。激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，吸收波長(zhǎng)510 nm。以正常穩(wěn)定狀態(tài)作為空白對(duì)照，隨后替換含一定濃度藥物外液作為待測(cè)藥物的藥效。實(shí)驗(yàn)中4個(gè)灌流順序均重復(fù)6例，細(xì)胞外液體更換順序及數(shù)據(jù)分組同上體外心臟實(shí)驗(yàn)，比較伊伐布雷定分別在H89、KN-93及CA干預(yù)下對(duì)鈣釋放幅值的影響。

2 結(jié) 果

2.1伊伐布雷定對(duì)體內(nèi)大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的作用結(jié)果表明給藥組LVDP、心輸出量(CO)及動(dòng)脈收縮壓(SBP)較空白組顯著增加(P<0.05)，心率降低(P<0.05)，而舒張壓(DBP)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。大鼠左心室發(fā)展壓、動(dòng)脈壓變化的代表性曲線見圖1。

動(dòng)力學(xué)參數(shù)LVDP(mmHg)HR (次/min)CO (mL/min)SBP (mmHg)DBP (mmHg)空白A組(n=7)102.43±11.06348.56±10.0233.72±1.9699.74±8.6754.71±3.30給藥A組(n=7)109.86±11.65?324.17±11.33?36.27±2.22?108.57±9.24?55.85±3.67

與空白A組比較，*P<0.01

圖1 伊伐布雷定對(duì)大鼠左心室和主動(dòng)脈壓力作用的代表性曲線

Figure 1 Representative curves of rat left ventricular and aortic pressure changes by ivabradine

2.2伊伐布雷定及其在H89和KN-93及CA干預(yù)對(duì)體外大鼠收縮力的作用給藥B組LVDP(144.05±5.75)較空白B組(100.00±7.68)明顯增加(P<0.01)。H89處理組及KN-93處理組左心室發(fā)展壓顯著低于其對(duì)照組(P<0.01)，CA處理組較CA對(duì)照組顯著增加(P<0.01)；伊伐布雷定+KN-93處理組大鼠體外心臟發(fā)展壓較KN-93處理組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。伊伐布雷定對(duì)大鼠左心室發(fā)展壓變化的代表性曲線見圖2。

組別nLVDP(mmHg)鈣釋放幅值H89對(duì)照組6100.00±25.91100.00±35.46H89處理組687.15±19.80?89.33±37.56??伊伐布雷定+H89處理組6100.12±23.75#95.75±38.83?#KN-93對(duì)照組6100.00±32.91100.00±24.10KN-93處理組692.99±30.85△△87.89±16.37△伊伐布雷定+KN-93處理組694.39±29.91△86.60±16.62△CA對(duì)照組6100.00±25.30100.00±37.29CA處理組6131.51±18.67○○116.06±48.07○伊伐布雷定+CA處理組6142.97±19.91○○●●122.86±44.51○○●

與H89對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與H89+伊伐布雷定處理組比較，#P<0.05；與KN-93對(duì)照組比較，△P<0.05、△△P<0.01；與CA對(duì)照組比較，○P<0.05，○○P<0.01；與CA+伊伐布雷定處理組比較，●P<0.05，●●P<0.01

圖 2 伊伐布雷定及在H89和 KN-93及CA干預(yù)下對(duì)大鼠體外心臟LVDP作用的代表性曲線

Figure 2 Representative curves of ratLVDPchanges by ivabradine in the absence and presence of H89 or KN-93 or CA

2.3伊伐布雷定及其在H89和KN-93及CA干預(yù)對(duì)大鼠左心室心肌細(xì)胞鈣釋放的作用實(shí)驗(yàn)表明給藥B組左心室肌細(xì)胞鈣釋放的幅值(118.06±16.81)較空白B組(100.00±8.42)增加 (P<0.01)。H89處理組及KN-93處理組左心室肌細(xì)胞鈣釋放的幅值均低于其對(duì)照組(P<0.05)，CA處理組較CA對(duì)照組顯著增加(P<0.01)。其中，伊伐布雷定+KN-93處理組大鼠體外心臟發(fā)展壓相較KN-93處理組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。大鼠左心室肌細(xì)胞鈣釋放幅值變化的代表性曲線見圖3。

圖 3 伊伐布雷定及在H89和 KN-93及CA干預(yù)下對(duì)大鼠左心室肌細(xì)胞Ca2+瞬變作用的代表性曲線

Figure 3 Representative curves of ratleft ventricular myocyte Ca2+transient changes by ivabradine in the absence and presence of H89 or KN-93 or CA

3 討 論

傳統(tǒng)的β受體阻滯劑在降低心率的同時(shí)，也產(chǎn)生負(fù)性肌力作用，使得部分患者不能耐受，尤其對(duì)哮喘患者[18]。伊伐布雷定對(duì)血壓偏低的慢性充血性心力衰竭、快速房性心律失常及竇性心動(dòng)過速患者，其臨床療效及安全性明顯好于β受體阻滯劑[19]。對(duì)伊伐布雷定的基礎(chǔ)及臨床研究較多關(guān)注心率的變化(變時(shí)作用)對(duì)心衰及心肌缺血的作用，而對(duì)心肌收縮力(變力作用)的研究較少，伊伐布雷定正性肌力作用的研究呈現(xiàn)不一致報(bào)道[9-10]。但越來越多的研究表明伊伐布雷定的臨床治療作用不僅僅是通過抑制If電流減慢心率，其作用機(jī)制是多方面的[6]，其中多樣性機(jī)制之一是伊伐布雷定增加心衰大鼠的心肌收縮力[7,20]。

大鼠體內(nèi)雙壓力導(dǎo)管實(shí)驗(yàn)表明伊伐布雷定在顯著降低心率的條件下，仍能增加心輸出量，且能增加室內(nèi)壓、主動(dòng)脈收縮壓及心輸出量。這種體內(nèi)大鼠的正性肌力作用，同樣在4 Hz頻率(即心率為240)觸發(fā)下大鼠體外心臟灌流實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步得到確認(rèn)。采用電生理的方法，用固定頻率觸發(fā)體外心臟收縮，排除伊伐布雷定引起心率下降對(duì)收縮力的影響。至此，通過體內(nèi)及體外心臟實(shí)驗(yàn)，明確了伊伐布雷定的正性肌力作用是獨(dú)立于神經(jīng)體液及心率變化。

本研究另外一個(gè)研究重點(diǎn)是探索其正性肌力作用的靶點(diǎn)，雖然有研究表明伊伐布雷定臨床治療作用機(jī)制是多方面的。但文獻(xiàn)報(bào)道表明，給予糖尿病小鼠灌胃伊伐布雷定四周，能夠明顯改善其心臟收縮或舒張功能，增加糖尿病小鼠心肌細(xì)胞受磷蛋白(Phospholamban, PLB)-17位磷酸化[8]。在正常生理情況下，心肌細(xì)胞發(fā)生去極化后，鈣離子通過L型鈣通道流入到胞內(nèi)，產(chǎn)生鈣誘導(dǎo)的鈣釋放，激活肌漿網(wǎng)囊泡上的蘭尼堿受體，導(dǎo)致其釋放大量的鈣離子到細(xì)胞質(zhì)中，產(chǎn)生心肌收縮。胞內(nèi)高鈣濃度激活了肌漿網(wǎng)囊泡上的鈣泵(SERCA2a)，超過70%的鈣離子被鈣泵攝入肌漿網(wǎng)內(nèi)[21]。PLB(受磷蛋白)發(fā)揮調(diào)節(jié)SERCA2a活性的重要作用，PLB去磷酸化時(shí)與SERCA2a相結(jié)合，抑制SERCA2a對(duì)鈣離子的親和力。而PLB磷酸化后與SERCA2a解離，SERCA2a對(duì)鈣離子的親和力增加，對(duì)鈣離子的回?cái)z能力提高[22]。PLB有3個(gè)磷酸化位點(diǎn)，即絲氨酸-16、蘇氨酸-17、絲氨酸-10位點(diǎn)；絲氨酸-16位點(diǎn)由蛋白激酶A磷酸化，蘇氨酸-17位點(diǎn)由CaMKⅡ磷酸化，蛋白磷酸酶去磷酸化[23-24]。本研究的體外心臟灌流實(shí)驗(yàn)表明CaMKⅡ的抑制劑KN-93能夠阻斷伊伐布雷定的增加體外大鼠心臟收縮力的作用，表明其作用靶點(diǎn)與CaMKⅡ有關(guān)。而進(jìn)一步的鈣釋放實(shí)驗(yàn)表明CaMKⅡ的抑制劑KN-93能夠阻斷伊伐布雷定的增加鈣釋放的作用。但伊伐布雷定通過CaMKⅡ發(fā)揮正性肌力作用機(jī)制仍然有待進(jìn)一步研究。

本研究表明伊伐布雷定對(duì)正常大鼠具有正性肌力作用，其作用機(jī)制是通過CaMKⅡ發(fā)揮作用，與抑制If電流無關(guān)。臨床上慢性充血性心力衰竭的治療，β受體阻滯劑由于在降低心率的同時(shí)存在負(fù)性肌力的作用而限制了其臨床上的應(yīng)用；而伊伐布雷定在降低心率的同時(shí)，仍然能增強(qiáng)心肌收縮力。因此，伊伐布雷定優(yōu)于β受體阻滯劑，不僅僅是β受體阻滯劑具有負(fù)性肌力作用，還在于伊伐布雷定的正性肌力作用。