李恒善 云耀峰 梁潤 郝靈芳 蒼宏宇

【摘要】 目的 探究應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法對惡性腫瘤原代細(xì)胞培養(yǎng)進行規(guī)范化體外藥敏試驗的可行性和實用性。方法 30例惡性腫瘤患者的新鮮腫瘤組織， 進行原代細(xì)胞培養(yǎng)純化。采用MTT比色法規(guī)范化檢測12種腫瘤化療藥物對人惡性腫瘤原代細(xì)胞培養(yǎng)進行體外藥敏試驗。結(jié)果 紫杉醇、多西他賽對胃癌和結(jié)直腸癌原代培養(yǎng)細(xì)胞的藥物敏感性均為77.78%， 而對乳腺癌原代培養(yǎng)細(xì)胞的藥物敏感性為88.89%;阿霉素對結(jié)直腸癌、胃癌以及乳腺癌原代培養(yǎng)細(xì)胞的藥物敏感性依次為66.67%、55.56%、55.56%;表阿霉素依次為77.78%、77.78%、66.67%;環(huán)磷酰胺和順鉑依次為66.67%、88.89%、77.78%;卡鉑依次為55.56%、77.78%、77.78%;奧沙利鉑依次為77.78%、88.89%、88.89%;氟尿嘧啶依次為77.78%、66.67%、55.56%;吉西他濱依次為66.67%、77.78%、66.67%;長春瑞濱依次為77.78%、66.67%、66.67%;依托泊苷依次為66.67%、77.78%、77.78%。結(jié)論 MTT法對于臨床合理用藥， 實現(xiàn)腫瘤患者的個體化化療具有重要的價值。

【關(guān)鍵詞】 四甲基偶氮唑鹽比色法;惡性腫瘤;藥敏試驗;化療

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.03.094

MTT法為一種用于檢測細(xì)胞生長和存活的方法[1， 2]， 主要是通過測定活細(xì)胞內(nèi)線粒體能量代謝過程中的脫氫酶將MTT代謝還原為不溶性紫色的甲簪沉淀產(chǎn)物， 而死細(xì)胞不著色[3， 4]。通過MTT染色及個性化篩選， 為臨床更好的使用化療藥物對惡性腫瘤細(xì)胞進行化療治療提供參考依據(jù)。本研究將對MTT法進行系統(tǒng)性的研究?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取本院2018年6月～2019年5月行初次手術(shù)的30例惡性腫瘤患者作為研究對象。其中， 男22例， 女8例;年齡26～72歲， 平均年齡（52.6±8.87）歲;乳腺癌12例， 胃癌9例， 結(jié)直腸癌9例。

1. 2 方法

1. 2. 1 化療藥物的配制 分別選取紫杉醇、多西他賽、阿霉素、表阿霉素、環(huán)磷酰胺、順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、氟尿嘧啶、吉西他濱、長春瑞濱、依托泊苷12種常見化療藥物， 均為臨床用注射針劑， 用腫瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基配制。配好的實驗藥物置于-20℃保存， 應(yīng)用時需提前放置室溫。

1. 2. 2 惡性腫瘤組織的取材 選取患者的新鮮腫瘤組織， 取材時應(yīng)避開破潰、壞死及液化部分， 以防污染。每例標(biāo)本應(yīng)于離體后5～20 min內(nèi)取材， 要求標(biāo)本直徑約0.5～1.0 cm， 剩余腫瘤組織用于病理， 取材后經(jīng)無菌生理鹽水沖洗后立即置無菌DHanks液中（保證腫瘤組織濕潤及營養(yǎng)）帶回實驗室， 并于30 min內(nèi)進行分離培養(yǎng)。

1. 2. 3 惡性腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)純化 于超凈工作臺內(nèi)取出標(biāo)本， 去除腫瘤組織周圍的脂肪、血管、纖維和壞死組織， 然后用平衡至常溫的DHank s液漂洗2～3遍至無血跡同時沖去廢棄組織。以手術(shù)刀和眼科剪迅速將標(biāo)本剪碎呈糊狀（大小約為1～2 mm3）。用消化培養(yǎng)法進行原代細(xì)胞培養(yǎng)， 加入0.25%的胰蛋白酶， 37℃條件下消化20 min后用含有血清的培養(yǎng)基終止消化， 離心棄去上清， 磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次。

應(yīng)用振蕩法使細(xì)胞充分散開， 經(jīng)200目（直徑0.76 mm）不銹鋼無菌濾網(wǎng)過濾， 棄去脂肪和較大的未解離組織。將最終收獲的腫瘤細(xì)胞置入25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。應(yīng)用腫瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基在37℃， 5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)純化。

1. 2. 4 惡性腫瘤細(xì)胞MTT法藥敏試驗 將培養(yǎng)純化得到的惡性腫瘤細(xì)胞， 制成細(xì)胞懸液， 調(diào)整細(xì)胞濃度為106/ml待用。本試驗根據(jù)所要檢測的化療藥物種類分為多個治療組， 另設(shè)一個陰性對照組和空白對照組， 每組復(fù)置3孔。具體加樣情況如下：治療試驗組：腫瘤細(xì)胞懸液100 μl/孔+化療藥物10 μl/孔+腫瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基90 μl/孔（藥物終濃度為體內(nèi)血漿高峰濃度10倍）;陰性對照組：腫瘤細(xì)胞懸液

100 μl/孔+腫瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基100 μl/孔;空白對照組：腫瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基200 μl/孔;將加好樣的96孔無菌培養(yǎng)板， 置37℃、5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后， 每孔中加入MTT溶液（5 mg/ml）20 μl， 上述條件繼續(xù)培養(yǎng)4 h， 離心棄上清， 再加甲臜溶劑三聯(lián)液100 μl， 于37℃放置過夜， 待甲臜結(jié)晶徹底溶解后， 在酶標(biāo)儀上比色， 測出每孔在波長570 nm波長處吸光度A值。藥物對腫瘤細(xì)胞的抑制率=[1-（治療試驗孔平均A值/陰性對照孔平均A值）]×100%。抑制率>50%為高度敏感， 抑制率30%～50%為中度敏感， 抑制率<30%為耐藥。

2 結(jié)果

紫杉醇、多西他賽對胃癌和結(jié)直腸癌原代培養(yǎng)細(xì)胞的藥物敏感性均為77.78%， 而對乳腺癌原代培養(yǎng)細(xì)胞的藥物敏感性為88.89%;阿霉素對結(jié)直腸癌、胃癌以及乳腺癌原代培養(yǎng)細(xì)胞的藥物敏感性依次為66.67%、55.56%、55.56%;表阿霉素依次為77.78%、77.78%、66.67%;環(huán)磷酰胺和順鉑依次為66.67%、88.89%、77.78%;卡鉑依次為55.56%、77.78%、77.78%;奧沙利鉑依次為77.78%、88.89%、88.89%;氟尿嘧啶依次為77.78%、66.67%、55.56%;吉西他濱依次為66.67%、77.78%、66.67%;長春瑞濱依次為77.78%、66.67%、66.67%;依托泊苷依次為66.67%、77.78%、77.78%。見圖1。

3 討論

惡性腫瘤治療采取化療方案的個體化一直是臨床工作中的一個難題， 因此， 科研人員不斷經(jīng)過摸索建立了多種腫瘤藥物化療的藥敏檢測方法[5]。MTT法具有多種優(yōu)點， 為目前進行腫瘤藥敏試驗最有效的方法之一[6， 7]。

MTT法可有效反映腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性， 與臨床療效的相關(guān)性較好。然而， MTT方法也存在局限性， 其尚未有一個公認(rèn)的統(tǒng)一技術(shù)順序[8]。因此， 本研究主要對MTT方法學(xué)進行系統(tǒng)研究， 針對該方法操作的各環(huán)節(jié)如細(xì)胞濃度、受試藥物濃度、細(xì)胞培養(yǎng)時間、MTT培養(yǎng)時間等進行合理優(yōu)化和選擇， 進而確定本實驗室的MTT法規(guī)范化操作流程。通過MTT法對人惡性腫瘤原代培養(yǎng)細(xì)胞進行規(guī)范化體外藥敏試驗發(fā)現(xiàn)， MTT法可較準(zhǔn)確的反映不同腫瘤患者對12種不同腫瘤化療藥物的敏感性差異別， 其檢測結(jié)果與臨床療效具有較好的吻合性。此外， 與以往傳統(tǒng)腫瘤藥敏試驗相比， 本研究在腫瘤原代細(xì)胞培養(yǎng)純化方面進行了明顯改進， 可大量減少成纖維細(xì)胞及人體其他正常組織成分對藥敏試驗的干擾， 具有一定創(chuàng)新性。

綜上所述， 本研究通過MTT法對惡性腫瘤原代細(xì)胞培養(yǎng)進行規(guī)范化體外藥敏試驗， 確定了該試驗的操作流程。

參考文獻(xiàn)

[1] Siegel RL， Miller KD， Jemal A. Cancer statistics， 2017. CA Cancer J Clin， 2017， 67（1）：7-30.

[2] 蔡燕， 彭乙華， 黃義山， 等. MTT法在細(xì)菌活性檢測及藥敏試驗中的應(yīng)用. 中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新， 2011， 8（5）：1-3.

[3] 冷冬. MTT法簡介及在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用展望. 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)， 2012， 42 （4）： 64-65.

[4] Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival： application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods， 1983， 65 （1-2）：55-63.

[5] 姚清深， 俸小平， 秦軍， 等. 大腸癌細(xì)胞的藥敏試驗結(jié)果分析及臨床意義. 腫瘤基礎(chǔ)與臨床， 2007， 20 （2）：169-170.

[6] 李上標(biāo)， 裴淑艷， 蔣超， 等. MTT比色法研究應(yīng)用進展. 西北民族大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2013， 34（3）：68-73， 91.

[7] 張海霞， 方蕓， 葛衛(wèi)紅， 等. 四氮哩鹽法腫瘤藥敏試驗及應(yīng)用. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志， 2005， 25（7）：663-664.

[8] 陳強， 張進華， 陳建庭， 等. 改良MTT藥敏分析在成骨肉瘤個體化治療中的意義. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)， 2011， 19（1）：153-155.

[收稿日期：2019-05-21]