重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)大鼠急性脊髓損傷后炎癥因子表達(dá)及運(yùn)動(dòng)功能的影響

吳海峰 胡治平 趙慧毅 華強(qiáng) 謝柏臻 張仕開

【摘要】 目的 研究重組人促紅細(xì)胞生成素（rhEPO）對(duì)大鼠急性脊髓損傷（SCI）后腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎癥因子的表達(dá)及運(yùn)動(dòng)功能的影響， 探討其減輕脊髓損傷、保護(hù)神經(jīng)功能的可能機(jī)制以及對(duì)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響。方法 36只SD大鼠， 采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（Sham組）、脊髓損傷組（SCI組）、治療組（EPO組）， 每組12只。Sham組：不損傷脊髓， 僅行椎板切除術(shù);SCI組和EPO組：行椎板切除術(shù)后， 均采用改良的Allen's撞擊法造成脊髓損傷。EPO組于術(shù)后1 h、1 d、3 d、7 d、14 d腹腔注射rhEPO;Sham組及SCI組， 于術(shù)后1 h、1 d、3 d、7 d、14 d腹腔內(nèi)注射等量的0.9%氯化鈉溶液。術(shù)后第3天， 各組分別處死6只大鼠并取材， 用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè) TNF-α、IL-1β 、IL-6 的表達(dá)水平;并用脊髓損傷Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評(píng)分法評(píng)價(jià)大鼠術(shù)后第1、3、7、14 天的運(yùn)動(dòng)功能情況。比較三組脊髓組織中各炎癥因子表達(dá)情況及不同時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分。結(jié)果 術(shù)后第3天， Sham組的TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均低于SCI組及EPO組， EPO組的TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均低于SCI組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。BBB評(píng)分最高分21分， Sham組無(wú)脊髓損傷， 術(shù)后大鼠運(yùn)動(dòng)功能正常， BBB評(píng)分接近正常值。術(shù)后第1、3、7、14天， EPO 組和SCI組大鼠的BBB評(píng)分隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而升高， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。術(shù)后第1、3、7、14天， EPO 組和SCI組大鼠的BBB評(píng)分均低于Sham組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。術(shù)后第7、14天， EPO組大鼠的BBB評(píng)分分別為（10.04±1.01）、（12.50±1.17）分， 均高于SCI組（7.92±1.04）、（9.92±1.12）分， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 rhEPO可減少急性脊髓損傷后炎癥因子TNF-α、IL-1β 、IL-6的表達(dá)， 減輕炎癥反應(yīng)， 從而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)的作用;且rhEPO 可明顯改善脊髓損傷后大鼠的運(yùn)動(dòng)功能， 有利于神經(jīng)功能的恢復(fù)。

【關(guān)鍵詞】 脊髓損傷;重組人促紅細(xì)胞生成素;炎癥因子;運(yùn)動(dòng)功能

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.03.093

【Abstract】 Objective? ?To investigate the effects of recombinant human erythropoietin （rhEPO） on the expression of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6（IL-6） and motor function after acute spinal cord injury （SCI） in rats， and to explore the possible mechanism of its reduction of spinal cord injury and protection of nerve function， as well as its effect on the recovery of motor function. Methods? ?A total of 36 SD rats were divided into sham-operated group （Sham group）， spinal cord injury group （SCI group） and treatment group （EPO group） by random number table method， with 12 rats in each group. Sham group： no spinal cord injury， only laminectomy; SCI group and EPO group： after laminectomy， modified Allen's impact method was used to cause spinal cord injury. EPO group was intraperitoneally injected with rhEPO 1 h， 1 d， 3 d， 7 d and 14 d after operation. In the Sham group and SCI group， the same amount of 0.9% sodium chloride solution was injected intraperitoneally 1 h，?1 d， 3 d， 7 d and 14 d after operation. On 3rd day after operation， 6 rats in each group were killed and sampled， and the expression levels of TNF- α， IL-1β and IL-6 were detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. The exercise function of rats on the 1st， 3rd， 7th and 14th days after operation was evaluated by spinal injury Basso-Beattie-Bresnahan（BBB） score. The expression of inflammatory factors and BBB scores at different time points in the three groups were compared. Results? ?At 3rd day after operation， the levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 in Sham group was lower than those in SCI group and EPO group， and EPO group was lower than SCI group. Their difference was statistically significant （P<0.05）. The highest BBB score was 21 points. There was no spinal cord injury in the Sham group. The postoperative rats had normal motor function， and BBB score is close to normal. On the 1st， 3rd， 7th and 14th day after operation， BBB scores of EPO group and SCI group increased with time， and the difference was statistically significant （P<0.05）. On the 1st， 3rd， 7th and 14th day after operation， the BBB scores of EPO group and SCI group were lower than those of sham group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. On the 7th and 14th day after operation， the BBB scores of EPO group were （10.04±1.01）， （12.50±1.17） points respectively， which were higher than those of SCI group （7.92±1.04）， （9.92±1.12） points. The difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion? ?RhEPO can reduce the expression of inflammatory factors TNF-a， IL-1β and IL-6 after acute spinal cord injury， and reduce the inflammatory response， thereby playing a neuroprotective role.? rhEPO can significantly improve the motor function of rats after spinal cord injury and is beneficial to the recovery of nerve function.

【Key words】 Spinal cord injury; Recombinant human erythropoietin; Inflammatory factors; Motor function

脊髓損傷是脊柱骨折脫位中常見(jiàn)而嚴(yán)重的損傷， 不僅給患者帶來(lái)嚴(yán)重的身心傷害， 也給社會(huì)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前臨床上對(duì)脊髓損傷的治療效果欠佳， 對(duì)脊髓損傷后炎癥作用機(jī)制了解較少。近年來(lái)， 促紅細(xì)胞生成素（EPO）已被證明在神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)元死亡相關(guān)的損傷和其他疾病的各種體內(nèi)外模型中具有保護(hù)作用[1]。Okutan等[2]的研究表明， EPO具有抗細(xì)胞凋亡和抗炎的作用， 可顯著改善大鼠的早期運(yùn)動(dòng)功能。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)建立大鼠的SCI撞擊模型， 觀察rhEPO對(duì)大鼠SCI后TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)水平及運(yùn)動(dòng)功能的影響， 探討其減輕脊髓損傷、保護(hù)神經(jīng)功能的可能機(jī)制以及對(duì)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 大鼠來(lái)源 36只SD大鼠（SPF級(jí)， 體重220～250 g）， 由廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠飼養(yǎng)條件為：室溫20～25 ℃，?光照和黑暗持續(xù)時(shí)間為12 h， 可隨意獲取水和食物。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組（Sham組）、脊髓損傷組（SCI組）、治療組（EPO組）， 每組12只。

1. 2 方法 Sham組：不損傷脊髓， 僅行椎板切除術(shù);SCI組及EPO組：行椎板切除術(shù)后， 均采用改良的Allen's撞擊法造成脊髓損傷。EPO組于術(shù)后1 h、1 d、3 d、7 d、14 d腹腔注射rhEPO（按照5000 U/kg注射）;Sham組及SCI組于術(shù)后1 h、1 d、3 d、7 d、14 d腹腔內(nèi)注射等量的0.9%氯化鈉溶液。實(shí)驗(yàn)開始前， 大鼠經(jīng)腹腔注射1.5 %戊巴比妥鈉麻醉后（40 mg/kg）， 取俯臥位， 將大鼠固定于無(wú)菌操作臺(tái)上， 背部剃毛， 消毒后鋪無(wú)菌洞巾， 以T10棘突為中心作一長(zhǎng)約3 cm的正中切口， 依次分離各層組織， 顯露T9～T11的上下棘突及椎板， 用咬骨鉗咬除T10棘突及雙側(cè)椎板， 使硬脊膜充分暴露。然后用自制的改良Allen's裝置， 造成T10脊髓的急性挫傷。（在硬脊膜表面放置一個(gè)與其彎曲度一致的塑料墊片， 墊片上垂直放置一個(gè)帶有刻度的玻璃管， 讓重量為10 g的圓柱狀金屬棒， 在玻璃管的引導(dǎo)下， 從刻度3 cm的高度垂直下落， 使其撞擊墊片， 造成致傷力為30 gcf的脊髓損傷。）隨即大鼠出現(xiàn)身體顫抖， 尾巴痙攣性擺動(dòng)， 雙下肢迅速回彈， 術(shù)后大鼠出現(xiàn)雙側(cè)后肢軟癱， 肌張力消失， 損傷平面以下對(duì)刺激無(wú)反應(yīng)， 提示SCI模型制備成功。操作完成后， 用0.9%氯化鈉溶液沖洗傷口并逐層縫合， 術(shù)后所有大鼠飼養(yǎng)條件同前。脊髓損傷后， 每只籠飼養(yǎng)2只大鼠， 按壓大鼠膀胱3次/d， 直至恢復(fù)排尿功能。各組術(shù)后第3天完成BBB評(píng)分后， 分別處死6只大鼠， 沿原切口取出以 T10節(jié)段為中心長(zhǎng)約1.5 cm的傷段脊髓， 保存于液氮中備用。

1. 3 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn)

1. 3. 1 各炎癥因子的表達(dá)情況 rhEPO注射液購(gòu)自沈陽(yáng)三生制藥有限公司， TNF-α、IL-1β、IL-6 的ELISA 試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物科技有限公司。檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)情況， 采用ELISA法， 嚴(yán)格按照說(shuō)明書步驟操作。

1. 3. 2 BBB評(píng)分 參照Basso等提出的BBB評(píng)分法進(jìn)行評(píng)分， 滿分21分[3]。評(píng)分由2名非本組但熟悉 BBB 評(píng)分的研究人員進(jìn)行， 術(shù)后第1、3、7、14天對(duì)每只大鼠進(jìn)行BBB評(píng)分（術(shù)后第1、3天各組隨機(jī)抽取6只大鼠進(jìn)行評(píng)分， 以保證各時(shí)間點(diǎn)評(píng)分的大鼠數(shù)量一致）， 雙人獨(dú)立觀察， 主要觀察大鼠行走步態(tài)以及四肢關(guān)節(jié)的協(xié)調(diào)性。觀察時(shí)間≥4 min/次， 最終取平均值。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)， 多組比較采用方差分析;計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 三組脊髓組織中各炎癥因子表達(dá)情況比較 術(shù)后第3天， Sham組的TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均低于SCI組及EPO組， EPO組的TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均低于SCI組，?差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）， 說(shuō)明EPO可以明顯減少脊髓損傷后炎癥因子的表達(dá)。見(jiàn)表1。

2. 2 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分比較 BBB評(píng)分最高分21分， Sham組無(wú)脊髓損傷， 術(shù)后大鼠運(yùn)動(dòng)功能正常， BBB評(píng)分接近正常值。術(shù)后第1、3、7、14天， EPO組和SCI組大鼠的BBB評(píng)分隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而升高， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。術(shù)后第1、3、7、14天， EPO 組和SCI組大鼠的BBB評(píng)分均低于Sham組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

術(shù)后第7、14天， EPO 組大鼠的BBB評(píng)分均高于SCI組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

脊髓損傷的機(jī)制包括即刻的機(jī)械損傷（原發(fā)性損傷）和隨之發(fā)生的血管、生化反應(yīng)所致的繼發(fā)性損傷。其中繼發(fā)性損傷階段其病理生理機(jī)制涉及血管功能障礙、水腫、局部缺血、興奮性毒性、電解質(zhì)移位、自由基產(chǎn)生、炎癥和延遲的凋亡性細(xì)胞死亡[4]。研究表明， 炎癥反應(yīng)在脊髓繼發(fā)性損傷中起重要作用[5]。

在炎癥反應(yīng)中， TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)的進(jìn)展， 加重脊髓繼發(fā)性損傷的作用， 其主要病理機(jī)制包括[3]：①炎癥因子激活一系列的炎癥反應(yīng)加重脊髓組織的水腫和壞死;②炎癥因子刺激膠質(zhì)細(xì)胞增殖， 形成瘢痕;③TNF-α通過(guò)與其受體結(jié)合觸發(fā)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)， 導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡;④炎癥因子通過(guò)正反饋機(jī)制增強(qiáng)NF-B（核因子B）的表達(dá)， 從而形成級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)， 進(jìn)一步促進(jìn)TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達(dá)。Zhou等[6]通過(guò)研究表明， EPO可以降低受損腦組織中促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)， 減少中性粒細(xì)胞和分化簇3（CD3）+T細(xì)胞在腦組織中的浸潤(rùn)和活化， 增加抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10（IL-10）的表達(dá)， 從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)， 改善神經(jīng)和認(rèn)知功能。本文實(shí)驗(yàn)中顯示， 術(shù)后第3天， Sham組的TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均低于SCI組及EPO組， EPO組的TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均低于SCI組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）， 說(shuō)明EPO可以明顯減少脊髓損傷后炎癥因子的表達(dá)。說(shuō)明rhEPO可能通過(guò)抑制脊髓損傷后 TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)， 減輕炎癥反應(yīng)， 從而改善神經(jīng)功能。

EPO是一種在神經(jīng)保護(hù)中具有新興作用的細(xì)胞因子。EPO通過(guò)降低谷氨酸毒性， 增加抗細(xì)胞凋亡因子的產(chǎn)生， 減少炎癥和通過(guò)直接和間接抗氧化作用減少一氧化氮介導(dǎo)的損傷來(lái)促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）損傷后的神經(jīng)再生。Noguchi等[7]通過(guò)大鼠脊髓損傷模型發(fā)現(xiàn)EPO對(duì)大鼠神經(jīng)根撕脫傷后脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元具有神經(jīng)保護(hù)作用。Simon等[8]在兔的脊髓缺血/再灌注損傷模型上證實(shí)EPO可減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡， 且有助于運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)中， BBB評(píng)分最高分21分， Sham組無(wú)脊髓損傷， 術(shù)后大鼠運(yùn)動(dòng)功能正常， BBB評(píng)分接近正常值。術(shù)后第1、3、7、14天， EPO 組和SCI組大鼠的BBB評(píng)分隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而升高， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。術(shù)后第1、3、7、14天， EPO 組和SCI組大鼠的BBB評(píng)分均低于Sham組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。術(shù)后第7、14天， EPO 組大鼠的BBB評(píng)分分別為（10.04±1.01）、（12.50±1.17）分， 均高于SCI組（7.92±1.04）、（9.92±1.12）分， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說(shuō)明rhEPO 可明顯改善脊髓損傷后大鼠的運(yùn)動(dòng)功能， 有利于神經(jīng)功能的恢復(fù)。

總之， 本研究為EPO的神經(jīng)保護(hù)作用提供了一定的實(shí)驗(yàn)證據(jù)， 但是， 由于繼發(fā)性脊髓損傷涉及的機(jī)制繁多復(fù)雜， 因此仍然需要大量更深入的研究去揭示其本質(zhì)。鑒于EPO誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用越來(lái)越多， 相信在不遠(yuǎn)的將來(lái)EPO很可能成為臨床上治療脊髓損傷的有效治療方法。

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[收稿日期：2019-11-22]