灰飛虱中IKK相關基因的鑒定及其在水稻條紋病毒侵染中的功能

魯燕華, 盧 剛, 亓玉華, 葉莊新, 李俊敏, 陳劍平,*

(1. 浙江農林大學農業(yè)與食品科學學院, 浙江臨安 311300; 2. 寧波大學植物病毒學研究所, 浙江寧波 315211)

灰飛虱Laodelphaxstriatellus屬半翅目(Hemiptera)飛虱科(Delphacidae)，是稻飛虱的一種，主要為害禾本科植物(蔡邦華等, 1964)?；绎w虱廣泛分布于東亞、東南亞、歐洲、北非等地，中國各省均有發(fā)生，以長江中下游和華北稻區(qū)發(fā)生較多、危害最為嚴重。除直接取食汁液危害作物之外，灰飛虱還是多種植物病毒的傳播媒介，如水稻條紋病毒(rice stripe virus, RSV)和水稻黑條矮縮病毒(rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)等，嚴重影響我國糧食生產安全(浦茂華, 1963)?；绎w虱的生命周期分為卵、若蟲、成蟲3個階段。在解剖鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，灰飛虱的卵呈香蕉形，并且以卵塊或單位卵的形式產在水稻植株下部的葉鞘內或葉片組織中，抽穗后產卵于穗頸部內，卵期約7～11 d。灰飛虱產卵量大，每頭雌成蟲產卵可達100～300余粒，產卵期可持續(xù)數(shù)天。初產顏色為乳白色，后期淡黃色(王柳風等, 2013)。灰飛虱取食危害時分泌的“蜜露”，富含多種糖類和氨基酸，覆蓋在植株上，會引起真菌的滋生，導致稻穗發(fā)黑及霉變，嚴重影響水稻品質和產量(劉向東等, 2006)。近年來，灰飛虱傳播的水稻病毒病逐年加重，加上農藥濫用引起的灰飛虱抗藥性問題愈發(fā)突出，因此研究灰飛虱體內抗病毒過程中的相關基因功能，可為防控水稻病毒病提供科學依據(jù)。

在動物抗病反應中，核轉錄因子(nuclear factor kappa B, NF-κB)和干擾素(interferon, IFN)控制重要的信號級聯(lián)，介導了許多促炎細胞因子的轉錄表達，如炎細胞因子、粘附分子、生長因子及抗凋亡存活蛋白等(Mercurioetal., 1997; Rothwarfetal.,1998)。IκB激酶(IKK)及相關激酶是這些抗病通路的調節(jié)因子(DiDonatoetal., 1997; Pham and Tenoever, 2010)。在未受外界刺激的正常細胞中，NF-κB與其抑制因子IκB結合，細胞處于靜息狀態(tài)，被隔離在細胞質中。而當細胞受細胞因子或病原物刺激時，信號便通過細胞表面受體將信號轉化到IKK復合物上，IKK被激活導致 IκB磷酸化并通過泛素化酶識別使其降解(Karin and Ben, 2000)，與其結合的NF-κB被釋放出來，并從細胞質中易位至細胞核激活靶基因的表達，產生應激及免疫反應。IKK復合物是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，一般認為由IKKα, IKKβ及NEMO(IKKγ)3個亞基組成。IKKα和IKKβ具有較高的序列同源性和相似的結構，N末端均含有蛋白激酶區(qū)，因此具有絲氨酸蛋白激酶活性，可催化底物IκB發(fā)生磷酸化(Rothwarf and Karin, 1999)。近幾年，另外兩種與IKKα和IKKβ序列相似的IKK相關激酶也已被鑒定出，即IKKE(或稱為IKK-i)和TBK1(TANK-binding kinase 1)[或稱為NF-κB activated kinase (NAK)或TRAF2-associated kinase (T2K)](Tojimaetal., 2000)。IKKE和TBK1在NF-κB信號通路活化過程中與經典的IKK(IKKα和IKKβ)一樣都具有磷酸化靶點的作用，因此多把IKKE和TBK1稱為NF-κB的額外活化激酶，或者叫非經典IKKs(Kimetal., 2013)。兩者均具有保守的蛋白結構域，都包含一個N端激酶區(qū)域，一個羧基端亮氨酸拉鏈結構和一個螺旋-環(huán)-螺旋結構及一個C末端的NEMO結合域(Nakatsuetal., 2014)。TBK1作為通路的重要分子，在機體抗病毒、抗菌免疫以及信號傳導調控等方面均發(fā)揮著重要作用。敲除小鼠的TBK1基因，可導致小鼠的肝細胞凋亡，引起胚胎死亡(Bonnardetal., 2000)。而在細胞水平TBK1的過表達能夠引起經典的IKKβ以及NF-κB的激活(Kumaretal., 2011)。

目前關于IKK基因的相關研究主要集中在哺乳動物及模式昆蟲(如黑腹果蠅Drosophilamelanogaster, 埃及伊蚊Aedesaegypti)中，而在灰飛虱等植物病毒傳毒介體中還未見任何報道。本研究以灰飛虱為研究對象，從其基因組中篩選鑒定了灰飛虱的IKKα和TBK1，明確了其在灰飛虱不同發(fā)育階段及組織中的表達，并初步研究了其在RSV侵染過程中的功能，這些結果為進一步深入研究NF-κB免疫通路在植物病毒傳毒介體中的功能提供了豐富信息。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1植物材料：所用的水稻品種為武育粳3號，將水稻種子置于塑料筐并用自來水沖洗數(shù)次后浸泡，放置于30℃人工氣候培養(yǎng)箱浸種24 h；催芽1～2 d，每天及時更換浸種用水。待種子發(fā)芽后播種于透明玻璃燒杯中，蓋上透氣紗網(wǎng)培養(yǎng)。

1.1.2供試蟲源：本研究中所使用的灰飛虱有兩個種群，分別為無毒(RSV-free)及RSV侵染(RSV-infected)的灰飛虱，均為江蘇省農業(yè)科學院周益軍實驗室惠贈。帶毒灰飛虱種群的帶毒率利用RSV外殼蛋白(coat protein, CP)進行檢測，引物序列見表1。實驗室?guī)Ф净绎w虱種群經多代純化篩選，帶毒率穩(wěn)定在80%～90%。同時每個月在無毒灰飛虱種群中隨機抽取50頭灰飛虱進行病毒檢測，保證種群未受RSV污染?；绎w虱種群維持在常規(guī)粳稻(武育粳3號)上，于人工氣候室飼養(yǎng)?；绎w虱種群的飼養(yǎng)條件為: 26±1℃，光周期16L∶8D，相對濕度75%。每隔7 d更換一次水稻苗。

1.1.3試劑: DNA Marker, RNA Free H2O和TAE緩沖液等購自上海生工生物公司;瓊脂糖購自翊圣生物公司；KOD FX Neo高保真擴增酶購自TOYOBO公司；Trizol試劑盒購于賽默飛生物公司;氯仿購于上海凌風化學試劑有限公司；cDNA逆轉錄試劑盒購自天根生物公司；T7 RiboMAXTMExpress RNAi System試劑盒購于西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；qRT-PCR試劑ChamQ SYBR? qPCR Master Mix購于諾唯贊生物公司；酒精等其他試劑均為國藥集團化學試劑有限公司產品。

1.2 灰飛虱IKK相關基因的鑒定及生物信息學分析

利用其他昆蟲的IKK相關基因，包括黑腹果蠅D.melanogaster的IKKβ(GenBank登錄號: NM_080012.4),IKKγ(GenBank登錄號: NM_001259574.2, NM_079132.4),IKKE(GenBank登錄號: NM_165337.2, NM_136204.3), 白蟻Cryptotermessecundus的IKKα(GenBank登錄號: XP_023711368.1)和煙粉虱Bemisiatabaci的TBK1(GenBank登錄號: XM_019046304.1)為誘餌序列，與新建立的灰飛虱基因組本地庫(Zhuetal., 2017)進行Blast同源比對(設置e值<10-5)，鑒定并明確灰飛虱中IKK相關基因的核苷酸ORF序列及對應的氨基酸序列。進一步利用NCBI保守結構域數(shù)據(jù)庫預測IKK相關基因ORF中的保守結構域；在NCBI中尋找相應基因的同源序列，利用BioEdit軟件(版本: 7.0.9.0)進行同源序列比對；最后利用MEGA 7.0中鄰接法(neighbor-joining method)構建系統(tǒng)發(fā)生樹(bootstrap值為1 000次)。

表1 本研究所用引物信息Table 1 Information of primers used in this study

1.3 灰飛虱樣品收集、RNA提取及cDNA合成

以無毒及RSV帶毒灰飛虱為材料， 收集卵、 低齡若蟲(1-3齡)、高齡若蟲(4-5齡)、雄成蟲和雌成蟲不同發(fā)育階段樣本。其中，卵的收集是將處于產卵期的雌成蟲轉移至健康水稻苗上，2～3 d后，將水稻取出轉移至解剖鏡下收集產在莖基部的蟲卵。收集灰飛虱成蟲腸道、唾液腺、卵巢(雌成蟲)、血淋巴、脂肪體和精巢(雄成蟲)等不同組織。不同發(fā)育階段及組織的灰飛虱樣品均設3個生物學重復，每個生物學重復取10頭灰飛虱個體。

收集的新鮮樣品立即放入液氮冷凍，按Trizol試劑盒說明提取樣品總RNA，并利用RNA電泳和蛋白核酸定量分析儀檢測其質量。以上述提取的RNA為模板參照諾唯贊公司反轉錄試劑盒HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR說明書，用兩步法反轉錄獲得cDNA第1鏈。

1.4 RT-PCR檢測IKK相關基因在無毒灰飛虱中的表達

根據(jù)1.2節(jié)得到的灰飛虱IKK相關基因的核苷酸序列設計引物，IKKα和TBK1的引物序列見表1。以灰飛虱的18S rRNA(GenBank登錄號: JF773149.1)序列作為陽性對照，18S rRNA的引物序列見表1。以ddH2O作為陰性對照(CK)。用1.3節(jié)合成的無毒灰飛虱cDNA第1鏈為模板進行RT-PCR，明確IKKα和TBK1基因在灰飛虱不同發(fā)育階段及各個組織中是否表達。PCR反應體系(10 μL): 2×HieffTMPCR Master Mix (with Dye) 5 μL, 上下游引物(0.2 μmol/L)各0.3 μL, cDNA模板1 μL, ddH2O 3.4 μL。反應程序: 94℃預變性3 min; 94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 2 min 40 s, 35個循環(huán); 72℃ 10 min。用4 μL的2K Plus DNA Marker，取5～7 μL PCR產物經1%(m/v)的瓊脂糖凝膠電泳檢測。將含有目的條帶大小的回收產物送往擎科(杭州)生物公司進行DNA測序，測序正確后于-80℃保存或用于下一步dsRNA合成。

1.5 qRT-PCR檢測IKK相關基因在RSV帶毒和無毒灰飛虱中的表達

設計IKKα和TBK1基因的定量PCR引物，IKKα的引物序列見表1，引物擴增效率為98.3%。TBK1的引物序列見表1，引物擴增效率為90.5%。以灰飛虱actin(GenBank登錄號: AY192151.1)為內參基因，引物序列見表1。以1.3節(jié)合成的無毒和帶毒灰飛虱不同發(fā)育階段及成蟲各個組織cDNA第1鏈為模板，使用SYBR? Green Real-time PCR Master Mix進行qRT-PCR。反應體系(10 μL): 上下游引物(0.2 μmol/L)各0.3 μL, cDNA模板0.4 μL, ddH2O 4.0 μL。反應條件: 94℃ 4 min; 94℃ 15 s, 60℃ 15 s, 72℃ 20 s, 40個循環(huán)，用溶解曲線來確定擴增片段的特異性。

1.6 RNAi干擾RSV侵染后的灰飛虱中的IKK相關基因

通過PCR在目的基因序列兩端添加T7啟動子，dsGFP作為對照基因，按照T7 RiboMAX Express RNAi System(Promega, 美國)試劑盒說明書合成dsRNA; dsGFP, dsIKKα和dsTBK1的引物序列見表1。分別取 5～7 μL合成后的 dsRNA進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測其條帶大小。確認dsRNA完整度和大小無誤后，使用紫外分光光度計測定dsRNA濃度和純度待用。取齡期一致的RSV帶毒灰飛虱3齡若蟲，用CO2麻醉后，選用顯微注射儀對若蟲第2和第3腹節(jié)之間進行注射(每頭注射約100 ng dsRNA)，每次至少重復20頭灰飛虱。將注射dsRNA的灰飛虱若蟲置于25℃室溫飼養(yǎng)4 d后單頭取樣，按照1.3節(jié)方法提取RNA，反轉成cDNA，-80℃保存用于后續(xù)qRT-PCR。

1.7 qRT-PCR檢測RSV侵染后的灰飛虱中IKK相關基因的RNAi干擾效率及RSV病毒含量

取1.6節(jié)中RNAi處理4 d后的灰飛虱樣品，利用qRT-PCR分別檢測IKKα和TBK1的表達量以及帶毒灰飛虱中RSV外殼蛋白的表達量變化，方法同1.5節(jié)。其中，IKKα,TBK1和RSV-CP的qRT-PCR引物序列見表1，RSV-CP的引物擴增效率為95.7%。

1.8 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)使用Excel 2007和GraphPad Prism 6進行分析、處理和繪圖，數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用Student氏t檢驗方法進行分析，P<0.05表示樣本間存在顯著差異，P<0.01表示樣本間存在極顯著差異。

2 結果

2.1 灰飛虱IKK相關基因的克隆及序列分析

利用同源比對方法從灰飛虱基因組中鑒定和克隆了灰飛虱的兩個IKK相關基因的ORF，經NCBI 蛋白數(shù)據(jù)庫BlastX比對分析表明這兩個基因為IKKα(GenBank登錄號: MK903504)和TANK結合激酶1(TANK-binding kinase 1)基因TBK1(GenBank登錄號: MN124506)。NCBI同源比對結果表明，與灰飛虱IKKα同源性最高的為褐飛虱NilaparvatalugensIKKα(GenBank登錄號: XP_022189635.1)，氨基酸序列一致性為92%；其次為堆砂白蟻CryptotermessecundusIKKα(GenBank登錄號: XP_023711368.1)和西花薊馬FrankliniellaoccidentalisIKKα(GenBank登錄號: XP_026290137.1)，氨基酸序列一致性分別為38%和44%。與灰飛虱TBK1同源性最高的為褐飛虱TBK1(GenBank登錄號: XP_022189807.1)，氨基酸序列一致性為97%；其次為煙粉虱BemisiatabaciTBK1(GenBank登錄號: XP_018901849.1)和茶翅蝽HalyomorphahalysTBK1(GenBank登錄號: XP_014288800.1)，氨基酸序列一致性分別為75%和75%。IKKαORF全長2 379 bp，編碼792個氨基酸；TBK1 ORF全長1 551 bp，編碼516個氨基酸(圖1)。保守結構域分析結果表明，和已報道的其他動物中的IKK結構類似，灰飛虱IKKα和TBK1均具有1個保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域和1個泛素折疊區(qū)域(圖1)，這兩個功能結構域對NF-κB免疫信號通路的活化過程中具有關鍵作用(趙運旺, 2016)。

圖1 灰飛虱IKKα和TBK1基因ORF結構示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the structures of IKKɑ and TBK1 ORFs in Laodelphax striatellus

2.2 灰飛虱IKKα 和TBK1的系統(tǒng)進化分析

利用NCBI中的同源序列，對不同物種IKKα和TBK1的氨基酸序列進行多重序列比對分析，并進一步構建兩個蛋白的系統(tǒng)發(fā)生樹。系統(tǒng)進化分析表明，IKK及其相關蛋白的系統(tǒng)進化樹主要為兩個大分支，第1個分支為IKKα，第2個分支包括IKKE和TBK1(圖2)?；绎w虱的IKKα和TBK1在系統(tǒng)分類樹中有明確的分支定位，進一步明確了灰飛虱中這兩個IKK相關基因的具體分類。灰飛虱的IKKα和西花薊馬、堆砂白蟻和濕木白蟻Zootermopsisnevadensis這3種昆蟲的相應基因聚類較近，而灰飛虱TBK1則與茶翅蝽、煙粉虱、柑桔木虱Diaphorinaciti具有較高的親緣關系(圖2)。

圖2 灰飛虱及其他物種基于IKK相關蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進化分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of Laodelphax striatellus and other species based on the amino acid sequences of the IKK related proteins 灰飛虱的IKKɑ和TBK1以三角符標記；分支上的數(shù)字表示1 000次重復抽樣符合聚類的百分數(shù)；標尺表示每單位長度位點替代率。IKKɑ and TBK1 of L. striatellus are marked with a triangle symbol. The numbers on the branches represent the percentages of times that the species are grouped together in the bootstrap analysis for 1 000 replicates. The scale bar indicates the number of substitutions per site for a unit of branch length.

2.3 IKKɑ和TBK1在無RSV的灰飛虱不同齡期、成蟲不同組織中的表達

為全面了解IKKɑ和TBK1在灰飛虱中的表達，我們利用RT-PCR方法對這兩個基因在無毒灰飛虱不同發(fā)育階段(卵期、1-5齡若蟲、雄成蟲和雌成蟲)及成蟲各個組織(腸道、唾液腺、血淋巴、脂肪體、卵巢和精巢)中的表達量進行了檢測。檢測結果如圖3所示，在灰飛虱各個齡期及成蟲組織中均能穩(wěn)定擴增出IKKɑ和TBK1，表明這兩個基因在灰飛虱所有齡期及成蟲組織中均廣泛存在并持續(xù)表達。

圖3 IKKɑ (A)和TBK1(B)在灰飛虱不同齡期和成蟲不同組織中的表達量Fig. 3 Relative expression levels of IKKɑ (A) and TBK1 (B) in different developmental stages and adult tissues of Laodelphax striatellusM: 2K Plus DNA Marker; E: 卵Egg; L1-5: 分別為1-5齡若蟲1st-5th instar nymph, respectively; MA: 雄成蟲Male adult; FA: 雌成蟲Female adult; G: 腸道Gut; Sg: 唾液腺Salivary gland; Hm: 血淋巴Hemolympph; Fb: 脂肪體Fat body; Ov: 卵巢Ovary; Te: 精巢Testis; 18S: 18S rRNA, 陽性對照18S rRNA as the positive control; CK: 空白對照Blank control.

圖4 RSV侵染后灰飛虱不同齡期IKKα(A)和TBK1(B)的相對表達水平Fig. 4 Relative expression levels of IKKα (A) and TBK1 (B) in different developmental stages of Laodelphax striatellus in response to RSV infectionRSV: RSV侵染 RSV-infected; RF: RSV未侵染RSV-free. E: 卵Egg; L1-5: 分別為1-5齡若蟲1st-5th instar nymph, respectively; MA: 雄成蟲Male adult; FA: 雌成蟲Female adult. 柱上單星號和雙星號分別表示同一個基因相對表達量在RF與RSV間存在顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)差異(Student氏t檢驗)。Single asterisk and double asterisk above bars indicate significant (P<0.05) and extremely significant (P<0.01) difference in the gene expression level between RF and RSV, respectively, by Student’s t-test. 圖5同The same for Fig. 5.

2.4 RSV侵染對IKKα和TBK1在灰飛虱不同齡期、成蟲不同組織中轉錄水平的影響

qRT-PCR結果表明，IKKα在無毒灰飛虱各個齡期表達相對穩(wěn)定，TBK1在無RSV侵染的2齡若蟲中的表達量最低。帶毒蟲中，隨著發(fā)育齡期的增加，IKKα的表達量不斷升高(2齡若蟲除外)，IKKα和TBK1在不同齡期的表達峰值均出現(xiàn)在灰飛虱的雌成蟲中(圖4)。RSV侵染后，IKKɑ在1齡、3-5齡若蟲及雌雄成蟲中的表達量均較無毒蟲的顯著增加(P<0.05)(圖4: A)；而TBK1在病毒侵染后的1-2齡、4齡若蟲及雌雄成蟲中表達量均較無毒蟲的顯著上調(P<0.05)(圖4: B)。兩個基因在帶毒雌成蟲中的表達量均比無毒蟲中的上調4倍以上(圖4)。

對于成蟲不同組織，無毒灰飛虱中IKKɑ在脂肪體和卵巢中高表達，帶毒蟲中除這兩個組織外，IKKɑ在唾液腺也具有很高的表達量。RSV侵染后，IKKɑ的表達量在帶毒蟲的唾液腺、血淋巴及精巢中相對于無毒蟲的相應組織中均極顯著上調(P<0.01)(圖5: A)。TBK1在無毒蟲中僅在卵巢中高表達，而帶毒蟲中TBK1在唾液腺、脂肪體和卵巢相對于其他組織均為高表達。 相對于無毒蟲，RSV侵染后，TBK1在唾液腺和脂肪體中均極顯著上調(P<0.01)(圖5: B)。 這些結果表明病毒侵染灰飛虱后期階段IKKɑ和TBK1在昆蟲的不同發(fā)育齡期及成蟲不同組織中存在不同的響應模式。比較有意思的是，TBK1僅在帶毒蟲血淋巴中較無毒蟲出現(xiàn)了極顯著下調(P<0.01)，同時病毒侵染并未對這兩個基因在卵巢中的表達量產生顯著影響(P>0.05)(圖5: A, B)。

2.5 RNAi干擾灰飛虱IKKα和TBK1對RSV侵染的影響

為進一步研究IKKα和TBK1在病毒侵染中的作用，利用dsRNA注射方法分別對帶毒灰飛虱3齡若蟲中的IKKɑ和TBK1進行干擾(dsGFP作為對照)。實驗結果表明，注射后4 d處理組灰飛虱中的IKKɑ和TBK1相對對照組(dsGFP)均極顯著下調(P<0.01)，抑制率達到近70%(圖6)。同時，qRT-PCR檢測對照及干擾相應基因后帶毒灰飛虱中的RSV外殼蛋白的積累量(CP基因的表達量)，結果表明IKKɑ被干擾后的灰飛虱及TBK1被干擾后的灰飛虱體內RSV CP積累量比對照分別極顯著上調了6倍和2倍(P<0.01)(圖7)，表明IKKɑ和TBK1在灰飛虱NF-κB抗病毒免疫信號通路的活化過程中很可能具有重要作用。

圖5 RSV侵染后灰飛虱成蟲不同組織中IKKα(A)和TBK1(B)的相對表達水平Fig. 5 Relative expression levels of IKKα (A) and TBK1 (B) in different adult tissues of Laodelphax striatellus in response to RSV infectionRSV: RSV侵染 RSV-infected; RF: RSV未侵染RSV-free. G: 腸道Gut; Sg: 唾液腺Salivary gland; Hm: 血淋巴Hemolympph; Fb: 脂肪體Fat body; Ov: 卵巢Ovary; Te: 精巢Testis.

圖6 分別注射IKKα(A)和TBK1(B) dsRNA后4 d帶毒灰飛虱3齡若蟲中靶基因的抑制效率Fig. 6 RNA interference efficiency of target genes in the 3rd instar nymphs of RSV-infected Laodelphax striatellus post injection of IKKα (A) and TBK1 (B) dsRNA, respectively, for 4 dActin為內參基因。柱上雙星號表示與對照組(dsGFP注射組)比較具有極顯著差異(P<0.01, Student氏t檢驗)。Actin is used as an internal reference gene. Double asterisk above bars indicates extremely significant difference (P<0.01, Student’s t-test) from the control group (dsGFP injection group). 圖7同The same for Fig. 7.

圖7 分別注射IKKα(A)和TBK1(B) dsRNA后4 d帶毒灰飛虱3齡若蟲中RSV積累量Fig. 7 Accumulation level of RSV in the 3rd instar nymphs of RSV-infected Laodelphax striatellus post injection of IKKα (A) and TBK1 (B) dsRNA, resepectively, for 4 dRSV積累量以RSV外殼蛋白(CP)基因的表達量表示。The accumulation level of RSV is expressed as the expression level of coat protein (CP) gene of RSV.

3 討論

脊椎動物免疫系統(tǒng)可分為先天免疫及獲得性免疫，在脊椎動物中，病毒、細菌、真菌等病原物入侵細胞，細胞中相關蛋白受體識別病原物并激活機體先天免疫系統(tǒng)抵御病原物的入侵(Janeway and Medzhitov, 1998)。目前一般認為無脊椎動物體內無獲得性免疫，其抵御外源病原物入侵主要依賴先天免疫系統(tǒng)(Wangetal., 2014)。IKK介導的NF-κB免疫信號通路的活化在無脊椎動物先天免疫中具有重要作用，NF-κB信號通路調節(jié)失控和炎癥、腫瘤、發(fā)育失調等多種病癥有直接關系(Liuetal., 2012)。目前，IKK及其相關基因在節(jié)肢動物中報道較少，在植物病毒傳毒介體昆蟲中還未見報道。

本研究從灰飛虱基因組中鑒定得到了兩個IKK相關基因同源物，同源比對及系統(tǒng)進化分析表明這兩個基因為IKKα和TBK1。雖然我們利用模式昆蟲中所有已知的IKK(IKKα,IKKβ及IKKγ)及其相關基因(IKKE和TBK1)作為種子序列挖掘灰飛虱中的IKK，但在灰飛虱中并未發(fā)現(xiàn)IKKβ,IKKγ及IKKE這3個基因。先前果蠅中的研究表明，果蠅的IKK復合物只包含IKKβ和IKKγ，但沒有IKKα(Ferrandonetal., 2007)。類似地，最新的研究表明甲殼動物泥蟹Scyllaparamamosain也只鑒定到了IKKβ和兩種不同的剪切形式的IKKE(Jiangetal., 2018)。因此灰飛虱中只鑒定到IKKα和TBK1，可能是由于灰飛虱中確實不存在另外幾種IKK相關基因。另外一種可能是由于目前灰飛虱的基因組還只是草圖，序列信息還不夠完善，還有部分基因未被充分挖掘。灰飛虱IKKα和TBK1均含有1個保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域和1個泛素折疊區(qū)域，同時兩個基因在灰飛虱不同發(fā)育階段和成蟲的不同組織中均廣泛表達，表明在進化過程中IKK及其相關基因的功能可能較保守。

NF-κB信號通路主要由Toll和IMD兩條通路組成，先前大量實驗表明其能被病原菌(細菌、真菌和病毒)侵染所激活，并在昆蟲體液免疫中具有重要作用(盧新民和葉恭銀, 2006)。水皰性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)侵染胚胎纖維細胞可順利激活IκB激酶基因IKKβ的表達，進而誘導下游免疫反應，而IKKβ缺陷型細胞系則無法順利激活NF-κB信號通路，表明IKKβ在免疫抗病毒中有重要作用(Chuetal., 1999)。后續(xù)研究表明，新發(fā)現(xiàn)的IKK相關基因IKKE和TBK1在病毒侵染后同樣能激活NF-κB先天免疫反應，產生干擾素，抵御病毒入侵(Fitzgeraldetal., 2003)。本研究結果表明，RSV侵染灰飛虱后，IKKα和TBK1在特定齡期及組織中被激活，兩個基因均在帶毒灰飛虱雌成蟲中上調最明顯(圖4)，同時在成蟲唾液腺、血淋巴、精巢(IKKα)或唾液腺、脂肪體(TBK1)等組織中顯著上調(圖5)，結合RSV在灰飛虱中的卵傳特點及這些組織在植物病毒順利入侵介體昆蟲及循環(huán)復制中的重要作用(劉海建等, 2007)，推測IKKα和TBK1可能和灰飛虱中NF-κB介導的先天免疫抗病毒通路相關。隨后的RNAi干擾實驗也表明IKKα和TBK1在RSV侵染灰飛虱過程中確實發(fā)揮了重要作用。

果蠅中的最新研究結果表明，果蠅C病毒(Drosophila C virus, DCV)侵染干擾果蠅的IKKβ細胞系后，DCV的豐度相對于對照顯著上調，進一步的實驗表明IKKβ對調控果蠅細胞系中依賴于STING和NF-κB的抗病毒免疫通路具有重要作用；但果蠅IMD通路中的IKKγ在DCV侵染時則無此調控作用(Gotoetal., 2018)。另外，對蝦白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus, WSSV)和黃頭病毒(yellow head disease, YHV)侵染斑節(jié)對蝦Penaeusmonodon，對蝦中的IKKE1和IKKE2在侵染后6和24 h相對對照顯著上調，但IKKβ在兩種病毒侵染后表達量則無顯著改變(Nhnhkornetal., 2019)。這些研究結果表明同一物種中不同的IKK相關基因在應對病毒侵染過程中具有不同作用。因此，本研究IKKE和TBK1在病毒侵染后灰飛虱不同組織中呈現(xiàn)不同的表達模式，表明NF-κB免疫通路的IKK相關基因在抗病毒免疫反應中可能具有不同的功能，且可能具有組織特異性。本研究結果為深入研究介體昆蟲中NF-κB免疫通路提供了豐富信息，同時也提出了很多需要進一步研究的問題。如病毒侵染灰飛虱不同階段各個組織中IKK相關基因的表達模式，NF-κB免疫通路下游相關基因對RSV的響應，最后是否產生抗菌肽，產生何種抗菌肽應對RSV的侵染等，這些問題的明確有助于我們進一步深入理解介體昆蟲應對植物病毒的先天免疫機制。