甘肅隴南大紅袍花椒芳香油成分分析及其抑菌活性

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(1.西北師范大學(xué),生命科學(xué)學(xué)院,甘肅蘭州 730000;2.甘肅省特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心,甘肅蘭州 730070)

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)是蕓香科花椒屬植物。據(jù)目前研究我國(guó)現(xiàn)有45種不同的花椒,其中有13種屬于變種花椒[1]。其在我國(guó)分布廣泛,主要分布在四川、陜西、山西、甘肅等地區(qū)[2]?；ń分泻猩飰A、脂肪酸、香豆素、木脂素、酰胺、芳香油等化學(xué)成分,在這些化學(xué)成分中芳香油的含量最高[3-4]。中醫(yī)認(rèn)為,花椒性溫,味辛,除了可以作為調(diào)味品外,還具有眾多藥用功效,包括鎮(zhèn)痛、麻醉、抗菌、殺蟲、抗氧化等,在醫(yī)藥方面具有廣泛的應(yīng)用前景[5-6]。大紅袍為蕓香科落葉灌木或小喬蜀椒的果實(shí),果皮名椒紅,其被譽(yù)為“八大調(diào)味品”之一。研究表明大紅袍花椒中不僅含有大量的芳香油成分,而且還含有豐富的脂肪油成分,主要包括油酸、亞油酸、亞麻酸、棕櫚酸、棕櫚烯酸、硬脂酸、花生酸等成分,經(jīng)過(guò)提煉可以達(dá)到食用油的標(biāo)準(zhǔn),是一種藥食同源物質(zhì)[7]。

甘肅省隴南市武都區(qū)栽植花椒歷史悠久,自古就是優(yōu)質(zhì)花椒的故鄉(xiāng),素有“千年椒鄉(xiāng)”之美譽(yù)?；ń愤m生范圍廣,全區(qū)36個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)中有34個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)適宜發(fā)展花椒產(chǎn)業(yè)。其盛產(chǎn)的花椒品質(zhì)優(yōu)異,民間冠以“大紅袍”之稱。“大紅袍”花椒粒大飽滿、麻味醇厚,其提取的芳香油含量高,且藥效成分較多[8]。

對(duì)于花椒芳香油化學(xué)成分分析和抑菌效果研究,國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要研究的是不同地區(qū)大紅袍花椒芳香油的化學(xué)成分和抑菌效果,但是對(duì)于甘肅隴南地區(qū)的大紅袍花椒揮發(fā)油的化學(xué)成分和抑菌方面的研究未見報(bào)道。唐裕芳等[9]采用水蒸氣蒸餾法提取四川紅皮花椒中的芳香油,運(yùn)用GC-MS對(duì)其成分進(jìn)行分析鑒定,并對(duì)芳香油進(jìn)行抑菌活性研究,研究發(fā)現(xiàn)花椒芳香油中含有的烯醇及其酯類衍生物、萜烯類化合物等物質(zhì),具有較強(qiáng)的抑菌活性。干信等[10]采用水蒸氣蒸餾法提取陜西大紅袍花椒中的芳香油,并對(duì)其芳香油的抑菌性進(jìn)行研究,研究發(fā)現(xiàn)花椒芳香油不僅能抑制革蘭氏陰性菌,也能抑制革蘭氏陽(yáng)性菌,同時(shí)對(duì)霉菌、真菌也有抑制作用,尤其對(duì)青霉和黑曲霉的抑菌效果最好。本文以甘肅隴南的大紅袍花椒為研究對(duì)象,采用水蒸氣蒸餾法提取其花椒芳香油,并對(duì)芳香油的化學(xué)成分和抑菌性進(jìn)行分析研究,為隴南花椒的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大紅袍花椒 采自甘肅隴南地區(qū);金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,CMCC 26003)、大腸桿菌(Escherichiacoli,ATCC 25922)、破傷風(fēng)桿菌(Nicolaieri’sbacillus,ATCC 19406)、熒光假單胞桿菌(Pseudomonasfluorescence,ATCC 13525) 供試致病菌由西北師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供;乙醚(AR) 天津市津冬天正精細(xì)化學(xué)試劑廠。

7890A型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司;DRT-TW型調(diào)熱電熱套、JY2002型電子天平 力辰科技公司;BSC-1300ⅡA2生物安全柜 蘇州安泰公司;TS-100C恒溫?fù)u床 上海天呈公司;YXQ-SG46-280S高壓滅菌鍋 北京中西公司;營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(LB) 南通凱恒生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 芳香油提取 參照文獻(xiàn)[11]中提取芳香油的方法,進(jìn)行修改。稱取樣品100 g粉碎并過(guò)30目篩,裝入2000 mL的圓底燒瓶中,加蒸餾水800 mL及數(shù)粒玻璃珠,浸泡過(guò)夜,連接揮發(fā)油測(cè)定器及回流冷凝管,并在揮發(fā)油測(cè)定器中加入蒸餾水至溢流入圓底燒瓶中,將圓底燒瓶于電熱套上加熱,調(diào)節(jié)加熱溫度為120 ℃,蒸餾10 h后,停止加熱并冷卻。從揮發(fā)油測(cè)定器中放出提取物轉(zhuǎn)移至分液漏斗,加入少量乙醚進(jìn)行萃取,過(guò)濾,常溫下?lián)]干乙醚,得到黃色有特殊香味的芳香油,稱重計(jì)算得油率為6.223%,4 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.2.2 芳香油的測(cè)定條件

1.2.2.1 氣相色譜分析條件 氣相色譜條件:石英毛細(xì)管柱HP-5MS,30 m×0.25 mm,膜厚0.25 μm;升溫程序:初始溫度60 ℃以10 ℃/min升至210 ℃,保持2 min,再以4 ℃/min升至280 ℃,保持2 min;載氣:He;柱流量:1 mL/min;進(jìn)樣口溫度:280 ℃[12]。

1.2.2.2 質(zhì)譜分析條件 質(zhì)譜條件:EI源;電離電壓:70 eV;離子源溫度:250 ℃;掃描范圍:50～650 amu;進(jìn)樣量:2 μL;分流比:20∶1。

1.2.3 不同大紅袍花椒芳香油成分的對(duì)比 對(duì)甘肅隴南、陜西韓城、四川茂縣大紅袍花椒芳香油成分進(jìn)行對(duì)比。

1.2.4 芳香油的體外抑菌實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 供試菌懸液和芳香油供試品溶液的制備 將實(shí)驗(yàn)所用菌種金黃色葡萄球菌、破傷風(fēng)桿菌、大腸桿菌分別接種于營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(LB)上，在適宜溫度下37 ℃活化12 h,熒光假單胞桿菌在27 ℃活化12 h,最后再用無(wú)菌水制備成5 mL/L(1.5×108CFU/mL)的菌懸液,置于4 ℃冰箱中備用。將制得的大紅袍花椒芳香油按照倍比稀釋法,用營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(LB)作為溶劑,將其稀釋成80、40、20、10、5、2.5、1.25 mL/L 7個(gè)濃度梯度的溶液。

1.2.4.2 芳香油抑菌活性的測(cè)定 采用濾紙片擴(kuò)散法[10]。用打器將濾紙制作成直徑為6.0 mm的小圓紙片,將小圓片濾紙貼于已涂布5 mL/L菌懸液的LB培養(yǎng)基上,取大紅袍花椒芳香油5 μL滴到每張小圓濾紙片上,用無(wú)菌水作為對(duì)照,并將其放入37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。測(cè)量抑菌圈的直徑,重復(fù)3次。

1.2.4.3 芳香油的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)測(cè)定 參照文獻(xiàn)[10]的操作步驟,并稍作修改。將稀釋至一系列濃度梯度的芳香油中加入菌懸液,并將其放入37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,觀察菌體的生長(zhǎng)情況,此時(shí)的濃度為芳香油的最小抑菌濃度。繼續(xù)培養(yǎng)24 h,觀察菌體的生長(zhǎng)情況,此時(shí)的濃度為芳香油的最小殺菌濃度。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Origin、SPSS 20軟件對(duì)其所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 芳香油成分鑒定

運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)對(duì)隴南大紅袍花椒芳香油成分進(jìn)行分析鑒定,并用色譜峰面積歸一化法測(cè)定了各成分的相對(duì)百分含量,結(jié)果見圖1、表1。

圖1 隴南大紅袍芳香油總離子圖Fig.1 Total ionogram of aromatic oil in Longnan Dahongpao

表1 隴南大紅袍花椒芳香油化學(xué)成分及相對(duì)含量Table 1 Chemical constituents and relative contents of aromatic oil of Zanthoxylum bungeanum in Longnan Dahongpao

續(xù)表

2.2 芳香油成分分析

經(jīng)過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行分析,隴南大紅袍芳香油共分離出67個(gè)組分,鑒定出50種化學(xué)成分,占總量的92.49%,其中萜類化合物的含量最高,芳香族化合物含量次之。在已鑒定的化合物中,相對(duì)百分含量在1%以上的有12種,含量占被檢出物質(zhì)總量的81.83%,其主要的化學(xué)成分包括D-檸檬烯(32.08%)、右旋香芹酮(20.02%)、石竹烯(12.26%)、4-萜烯醇(2.92%)、肉豆蔻烯(2.76%)和芳樟醇(2.34%)等,其中含量最高的為D-檸檬烯,高達(dá)32.08%。上面八種主要化學(xué)成分占總量的76.96%。據(jù)最近研究表明,檸檬烯不僅是一種重要的香精香料添加劑,而且還具有抑菌性、防腐保鮮、抗氧化、抗炎癥等多種功效[13]。右旋香芹酮是植物芳香油中重要的抑菌活性成分[14]。其中檸檬烯、石竹烯等均是天然精油中重要的萜烯組分,為可以直接使用的天然食品香料,石竹烯具有抗炎殺菌、局麻、驅(qū)蚊蟲、抗抑郁等作用[15]。芳樟醇在花椒芳香油中的含量較高,其有抗菌殺蟲的功效[16]。其中還檢出了少數(shù)烷烴,其可能是芳香油本身含有的成分,就其原因還有待進(jìn)一步研究。

2.3 與陜西韓城、四川茂縣大紅袍花椒芳香油成分的對(duì)比

表2 不同地區(qū)大紅袍花椒芳香油的主要化學(xué)成分的對(duì)比Table 2 Comparison of main chemical constituents of Zanthoxylum bungeanum aromatic oil from different regions

注:-表示未檢測(cè)出。由表2可知,甘肅隴南、陜西韓城、四川茂縣的大紅袍花椒芳香油中均含有檸檬烯、芳樟醇、β-月桂烯、γ-松油烯、羅勒烯等化學(xué)成分,其中檸檬烯的含量在不同地區(qū)大紅袍花椒芳香油的含量均為最高,然而甘肅隴南地區(qū)的大紅袍花椒芳香油中檸檬烯的含量最高,達(dá)到32.08%。在甘肅隴南大紅袍花椒芳香油中含量較高的右旋香芹酮和石竹烯,在陜西韓城和四川茂縣的大紅袍花椒中均未檢測(cè)到。芳樟醇、羅勒烯在四川茂縣大紅袍花椒芳香油中含量均最高。而β-月桂烯、γ-松油烯在陜西韓城大紅袍花椒芳香油中含量均最高。芳樟醇在花椒中的含量較高,其有抗菌殺蟲的功效[16]。月桂烯本身可能具有一定的抑菌效果。羅勒烯、月桂烯等成分是花椒香氣的主要來(lái)源物質(zhì)。

2.4 芳香油抑菌效果

2.4.1 芳香油抑菌活性測(cè)定 通過(guò)對(duì)芳香油進(jìn)行抑菌活性測(cè)定,得到圖2、表3。

由表3可知,通過(guò)對(duì)隴南大紅袍花椒芳香油進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),4種菌出現(xiàn)了大小不同的抑菌圈。說(shuō)明了大紅袍花椒芳香油對(duì)4種細(xì)菌有不同程度的抑菌效果。其抑菌效果很可能與大紅袍花椒揮發(fā)油中化學(xué)成分含量較高的檸檬烯、右旋在香芹酮、石竹烯和芳樟醇等有關(guān),其具體的作用機(jī)制,還有待進(jìn)一步研究。

表3 隴南大紅袍芳香油的抑菌圈直徑(mm)Table 3 Bacteriostasis circle diameter of aromatic oil from Longnan Dahongpao(mm)

注：同列不同小寫字母表示差異顯著，P<0.05。

表4 不同濃度的大紅袍花椒芳香油的抑菌作用Table 4 Bacteriostasis of Dahongpao Zanthoxylum bungeanum fragrant oil with different concentrations

注:-表示不長(zhǎng)菌,+表示長(zhǎng)菌。

表5 不同濃度的大紅袍芳香油的殺菌作用Table 5 Sterilization of Dahongpao aromatic oil with different concentrations

注:-表示不長(zhǎng)菌,+表示長(zhǎng)菌。

圖2 隴南大紅袍芳香油對(duì)4種菌的抑菌效果Fig.2 Antimicrobial effect of aromatic oil from Longnan Dahongpao on four kinds of bacteria注:a:大腸桿菌;b:金黃色葡萄球菌;c:破傷風(fēng)桿菌;d:熒光假單胞桿菌。

2.4.2 芳香油的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測(cè)定 通過(guò)對(duì)芳香油進(jìn)行等比稀釋,測(cè)定其最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC),結(jié)果如表4、表5。

由表4、表5可知,大紅袍花椒芳香油對(duì)于這4種菌的抑菌效果會(huì)隨著其濃度的變化而變化。對(duì)于大腸桿菌,大紅袍花椒芳香油的MIC和MBC分別為2.5和10 mL/L;對(duì)于金黃色葡萄桿菌,大紅袍花椒芳香油的MIC和MBC分別為2.5和5 mL/L;對(duì)于破傷風(fēng)桿菌,大紅袍花椒芳香油的MIC和MBC分別為5.0和10 mL/L;對(duì)于熒光假單胞桿菌,大紅袍花椒芳香油的MIC和MBC分別為2.5和5 mL/L。其對(duì)于金黃色葡萄球菌和熒光假單胞桿菌的抑菌效果較好。

3 結(jié)論與討論

經(jīng)過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行分析,隴南大紅袍芳香油共分離出67個(gè)組分,鑒定出50種化學(xué)成分,占總量的92.49%,其中萜類化合物的含量最高,芳香族化合物含量次之。其主要的化學(xué)成分包括D-檸檬烯(32.08%)、右旋香芹酮(20.02%)、石竹烯(12.26%)、4-萜烯醇(2.92%)、肉豆蔻烯(2.76%)等,其中含量最高的為D-檸檬烯,高達(dá)32.08%。在甘肅隴南大紅袍花椒芳香油中含量較高的右旋香芹酮和石竹烯在陜西韓城和四川茂縣的大紅袍花椒中均未檢測(cè)到,這些不同之處可能與花椒的生長(zhǎng)地區(qū)有關(guān)。目前研究表明,花椒芳香油主要化學(xué)成分的種類和含量會(huì)因其生長(zhǎng)地區(qū)和品種的不同而不同[17-21]。在花椒芳香油中含量最高的檸檬烯不僅是一種重要的香精香料添加劑,而且具有抑菌性、防腐保鮮、抗氧化、抗炎癥等多種功效[13]。

通過(guò)對(duì)隴南大紅袍花椒芳香油進(jìn)行抑菌性研究,發(fā)現(xiàn)其對(duì)于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、破傷風(fēng)桿菌、熒光單胞桿菌這四種細(xì)菌均具有抑菌性,說(shuō)明隴南大紅袍花椒芳香油不僅對(duì)革蘭氏陰性菌(大腸桿菌和熒光假單胞桿菌)有抑菌效果,而且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌和破傷風(fēng)桿菌)也有抑菌效果。芳香油的抑菌效果隨著芳香油濃度的變化而變化,因此芳香油的MIC和MBC就至關(guān)重要,對(duì)于提取開發(fā)和生產(chǎn)天然抑菌劑并將其用于醫(yī)療行業(yè)提供了一定的理論基礎(chǔ)。但是對(duì)于芳香油中各種化學(xué)成分的協(xié)同作用機(jī)制和其抑菌活性在生產(chǎn)應(yīng)用中的實(shí)際效果都有待進(jìn)一步深入研究。