解淀粉芽孢桿菌mtnN基因?qū)ζ渖锖铣?S-腺苷甲硫氨酸的影響

阮麗英，溫志友，魏雪團,

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.愛荷華州立大學(xué)食品科學(xué)與人類營養(yǎng)系，美國 愛荷華州 埃姆斯 50013）

S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種重要的生物活性物質(zhì)，參與轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)硫和轉(zhuǎn)氨丙基等多種類型的生化反應(yīng)[1-2]，從而影響體內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)和磷脂等物質(zhì)的合成與代謝[3-4]。 SAM顯著影響細胞代謝活動，充足的SAM是維持機體正常運轉(zhuǎn)的重要保證，缺乏SAM會出現(xiàn)一系列不良癥狀[5-6]。 研究表明，SAM對肝病、關(guān)節(jié)炎及抑郁癥等疾病具有良好的預(yù)防和治療效果[7-11]。因此，開發(fā)SAM相關(guān)的功能食品和藥品具有重要的價值。

SAM可通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)，由微生物體內(nèi)的S-腺苷甲硫氨酸合成酶催化底物L(fēng)-甲硫氨酸和ATP合成[12]。 目前S A M 的研究主要集中在酵母菌、大腸桿菌（Escherichia coli）和谷氨酸棒桿菌，多通過強化微生物表達S-腺苷甲硫氨酸合成酶，進而將更多的L-甲硫氨酸轉(zhuǎn)化為SAM[13-14]。如He Junyun等[15]在畢赤酵母中強化表達外源S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因SAM2，并敲除SAM分支途徑中的β-胱硫醚合成酶基因，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后，工程菌在5 L發(fā)酵罐中SAM產(chǎn)量高達13.5 g/L。然而，以甲硫氨酸為底物成本較高，且甲硫氨酸轉(zhuǎn)化率較低（15%～42%），導(dǎo)致SAM價格高[16-17]。有研究者通過葡萄糖或天冬氨酸為原料合成SAM。如Chen Yawei等[18]以葡萄糖為底物從頭合成SAM，通過調(diào)控ATP和NADPH強化了E. coli合成SAM的能力，然而目前的產(chǎn)量不足10 mg/L； Han Guoqiang等[19]敲除了谷氨酸棒桿菌SAM支鏈途徑和抑制因子基因（mcbR、thrB和Ncgl2640），強化表達了血紅蛋白基因和甲硫氨酸合成酶基因，以葡萄糖為底物，SAM產(chǎn)量達到196.7 mg/L?？傮w而言發(fā)酵產(chǎn)量較低，有待進一步提高。

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）具有食用安全、生長快速、易于培養(yǎng)等優(yōu)點，目前已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域[20-21]。近年來，隨著芽孢桿菌系統(tǒng)生物學(xué)和基因操作工具的發(fā)展，極大推動了芽孢桿菌代謝工程的發(fā)展[22-23]。KEGG數(shù)據(jù)庫顯示，B. amyloliquefaciens中存在完整的SAM代謝途徑，然而還鮮見通過B. amyloliquefaciens發(fā)酵生產(chǎn)SAM的報道。在B. amyloliquefaciens中，基因mtnN編碼S-腺苷高半胱氨酸核苷酶（S-adenosylhomocysteine nucleosidase，SAHN，EC 3.2.2.9），如圖1所示，該酶既可以參加SAM循環(huán)途徑，又可以參加甲硫氨酸循環(huán)途徑，這兩個循環(huán)途徑都消耗SAM[24]。因此，提出假設(shè)：阻斷或降低mtnN基因的表達可同時抑制SAM循環(huán)途徑和甲硫氨酸循環(huán)途徑，從而促進SAM的積累。為驗證這個假設(shè)，本研究通過基因敲除技術(shù)和反義RNA抑制技術(shù)構(gòu)建系列工程菌株，考察mtnN基因?qū). amyloliquefaciens合成SAM的影響，闡釋了mtnN基因?qū)AM合成的影響規(guī)律，為SAM高產(chǎn)菌株的代謝工程育種提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究所用到的菌株和質(zhì)粒如表1、2所示。其中 E. coli DH5α用于構(gòu)建載體。

1.1.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物

本研究所用的主要引物見表3，引物合成和質(zhì)粒測序由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司和北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

表 3 實驗所用PCR引物Table 3 Sequences of primers used for PCR in this study

1.1.3 培養(yǎng)基

Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，酵母浸出粉5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，pH 7.2～7.4，固體培養(yǎng)基加瓊脂1.5%。

B. amyloliquefaciens電轉(zhuǎn)化感受態(tài)制備所用生長培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中添加0.5 mol/L山梨醇；洗滌培養(yǎng)基：0.5 mol/L甘露醇，0.5 mol/L山梨醇，10%（體積分?jǐn)?shù)）甘油；恢復(fù)培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中含有0.5 mol/L山梨醇，0.38 mol/L甘露醇。

SAM發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖80 g/L，蛋白胨10 g/L，玉米漿5 g/L，天冬氨酸3 g/L，尿素2 g/L，(NH4)2SO46.3 g/L， NaCl 2.5 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO4·7H2O 4.2 g/L，pH 6.5～6.7。

1.1.4 工具酶和試劑

Trans Start?FastPfu DNA聚合酶、Trans Start?easy Taq DNA聚合酶 北京全式金生物技術(shù)有限公司；dNTPS、DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DL5000 Marker 日本TaKaRa公司；瓊脂糖 西班牙Spanish公司；DNA抽提試劑盒 武漢楚誠正茂科技工程有限公司；DNA回收試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒 美國Omega BioTek公司；卡那霉素（kanamycin，Kan）、四環(huán)素（tetracycline，Tet）、溶菌酶、山梨醇、甘露醇（Biosharp進口分裝） 武漢楚誠正茂科技工程有限公司； 甲醇為色譜級，其他均為國產(chǎn)分析級純或進口分裝。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司；AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Alpha Imager EP凝膠成像系統(tǒng) 美國Alpha Innotech公司；AR5120通用型精密天平 美國奧豪斯公司；CR21G高速冷凍離心機 日本Hitachi公司；DYY-8C型電泳儀 北京六一儀器廠；H Q L 3 0 0 B 恒溫大幅振蕩搖床 武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司；Legend Micro17R高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司； MLS-3750高壓滅菌鍋 日本Sanyo公司；QL-861渦旋振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Research?固定量程移液器 德國艾本德股份公司；SKP-02.420電熱恒溫培養(yǎng)箱 黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2F 潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Thermal Cycler (My Cycler) PCR儀 美國Bio-Rad公司；722型分光光度計 上海奧譜勒儀器有限公司；DELTA 320 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分子水平操作

E. coli質(zhì)粒的小量抽提：美國Omega BioTek公司的質(zhì)粒提取試劑盒，參照說明書中提取步驟。

PCR擴增：所用引物見表3，依次加入常規(guī)PCR體系（表4）各成分，混勻后進行擴增反應(yīng)。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；12 ℃保持5 min。其中，退火溫度依據(jù)引物的Tm值，延伸時間依據(jù)基因片段大小和聚合酶擴增效率。

表 4 常規(guī)PCR體系Table 4 Reaction system of conventional PCR

SOE-PCR依次加入各成分（表5），混勻后進行擴增反應(yīng)。SOE-PCR程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，先運行8 個循環(huán)，后運行：95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)，72 ℃延伸5 min，12 ℃保持5 min。其中，退火溫度依據(jù)引物的Tm值，延伸時間依據(jù)基因片段大小。

表 5 SOE-PCR體系Table 5 Reaction system of SOE-PCR

DNA的純化及回收：按照純化及膠回收試劑盒（美國Omega BioTek公司）說明書上的步驟純化回收DNA。

1.3.2 mtnN基因缺失菌株的構(gòu)建

重組載體的構(gòu)建：選取m t n N 基因上下游序列約500 bp為同源臂片段，設(shè)計上游同源臂片段引物（ΔmtnN-AF和ΔmtnN-AR）和下游同源臂片段引物（ΔmtnN-BF和ΔmtnN-BR）。以B. amyloliquefaciensHZ-12的基因組DNA作為模板，分別擴增得到上下游同源臂片段，產(chǎn)物純化回收后作為兩段同源臂SOE-PCR的模板，用引物ΔmtnN-AF和ΔmtnN-BR進行擴增，產(chǎn)物純化回收后與敲除載體T2(2)-ori同時用BamHI和XbaI進行雙酶切，產(chǎn)物回收后用T4連接酶4 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α感受態(tài)細胞，挑取單菌落進行菌落PCR驗證，確定為陽性克隆后，提取質(zhì)粒測序，構(gòu)建成功的敲除載體為T2(2)-oriΔmtnN。

感受態(tài)的制備：B. amyloliquefaciensHZ-12平板劃線，挑取適量菌體接種于5 mL液體LB培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)8 h；培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于50 mL生長培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)3 h，使OD600nm達1.5～2.5；將培養(yǎng)液倒入無菌的50 mL離心管中，置冰上預(yù)冷10 min，6 500 r/min離心5 min收集菌體；用20 mL預(yù)冷的洗滌培養(yǎng)基洗滌菌體3～4 次，6 500 r/min離心5 min，棄上清液，將菌體重懸于800 μL洗滌培養(yǎng)基中，每100 μL分裝于1.5 mL離心管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

電轉(zhuǎn)化：將5～10 μL質(zhì)粒DNA（50 ng/μL）加入B. amyloliquefaciensHZ-12感受態(tài)細胞，輕柔混勻后轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的2 mm電轉(zhuǎn)化杯中，冰浴10 min后，電脈沖轉(zhuǎn)化儀2.4 kV電擊一次，迅速加入800 μL恢復(fù)培養(yǎng)基，于37 ℃、100 r/min恢復(fù)培養(yǎng)3 h，涂布于含Kan抗生素平板，37 ℃靜置培養(yǎng)16～18 h。挑取轉(zhuǎn)化子單菌落劃線于Kan抗性平板，培養(yǎng)10～12 h后進行菌落PCR驗證。

單交換菌株的篩選及驗證：驗證正確的陽性轉(zhuǎn)化子接種于含Kan抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，45 ℃、 180 r/min培養(yǎng)12 h；培養(yǎng)物稀釋10-6倍涂布Kan抗性平板，45 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；挑單菌落劃線于Kan抗性平板，45 ℃培養(yǎng)10 h左右，用驗證引物和T2引物進行菌落PCR驗證。

雙交換菌株的篩選及驗證：獲得的單交換菌株在5 mL LB液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代，每代12 h，每次取100 μL前一代培養(yǎng)物接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)；將最后一代培養(yǎng)物稀釋105～106倍，涂布LB平板；對其上長出的單菌落分別對應(yīng)點種于LB平板和含Kan的LB平板上；選取在LB平板生長而在含Kan的平板不生長的單菌落進行PCR驗證，篩選雙交換菌株。

1.3.3 反義RNA抑制mtnN基因表達工程菌的構(gòu)建

重組載體的構(gòu)建：通過引物m t n N a s R N A-F 和mtnNasRNA-1-R，以互補于目標(biāo)基因的5’端不翻譯序列和目標(biāo)基因編碼區(qū)的序列為模板進行擴增，通過NcoI和XhoI對具有反義RNA序列的pUC19-asRNA質(zhì)粒和PCR得到的目的片段asRNA分別進行雙酶切，然后將酶切后的質(zhì)粒和片段連接進行轉(zhuǎn)化，得到含有目的片段asRNA的質(zhì)粒pUC19-mtnNasRNA。通過引物P43-F和mtnNasRNAP43-R擴增P43啟動子，通過引物mtnNasRNA-F和rrnB-R（質(zhì)粒本身含有的終止子下游引物），以質(zhì)粒pUC19-mtnNasRNA為模板進行擴增，PCR產(chǎn)物回收純化后，以引物P43-F和rrnB-R進行SOE-PCR，用BamHI和XbaI對得到的片段進行雙酶切，回收純化后與同樣經(jīng)過雙酶切純化后的穿梭質(zhì)粒pHY300進行酶連，轉(zhuǎn)化后得到質(zhì)粒pHYmtnNasRNA-1。通過引物P43-F和mtnNasRNA-P43-R擴增P43啟動子，通過引物mtnNasRNA-F和mtnNasRNA-2-R（mtnNasRNA-3-R），以質(zhì)粒pHY-mtnNasRNA-1為模板進行擴增，產(chǎn)物回收純化后與pHY-mtnNasRNA-1質(zhì)粒同時用限制性內(nèi)切酶NcoI和XhoI進行雙酶切，產(chǎn)物回收后進行酶連，轉(zhuǎn)化后得到質(zhì)粒pHY-mtnNasRNA-2（pHYmtnNasRNA-3），所用的引物如表3所示。

電轉(zhuǎn)化：按1.3.2節(jié)方法制備B. amyloliquefaciensHZ-12的感受態(tài)細胞，將抽提得到的表達質(zhì)粒pHYmtnNasRNA-1、pHY-mtnNasRNA-2和pHY-mtnNasRNA-3以及空載體pHY300PLK分別電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，涂布Tet抗性平板，37 ℃培養(yǎng)12～16 h得到轉(zhuǎn)化子，取一定數(shù)量的轉(zhuǎn)化子分別進行菌落PCR驗證，引物用pHY300-F和pHY300-R。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)條件

從超低溫冰箱中取出保藏的菌種劃線LB平板培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)基12 h。挑取適量菌體于裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)9 h（反義RNA抑制mtnN基因表達工程菌種子培養(yǎng)基中加 8 μg/mL Tet抗生素）。吸取1.5%菌液接種于裝有25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，37 ℃、180 r/min發(fā)酵培養(yǎng)60 h，每個菌設(shè)置3 個搖瓶重復(fù)。

1.3.5 SAM的高效液相色譜檢測

取發(fā)酵液0.5 mL，加1.5 mL 0.4 mol/L高氯酸提取1 h（每15 min振蕩一次），10 000 r/min離心5 min。取800 μL上清液，加100 μL 2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值。利用高效液相色譜檢測，色譜柱為XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），檢測器為紫外檢測器，流動相為甲醇與40 mmol/L NH4H2PO2-2 mmol/L庚烷磺酸鈉（18∶82，V/V），流速0.8 mL/min，進樣量20 μL，柱溫30 ℃，檢測波長254 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實驗設(shè)計3 個重復(fù)，采用SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，評估數(shù)據(jù)差異的顯著性，計算±s，采用 Origin 8.5進行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 mtnN基因缺失對解淀粉芽孢桿菌SAM的影響

2.1.1 mtnN基因缺失菌株的構(gòu)建

利用1.3.2節(jié)方法構(gòu)建重組載體T2(2)-oriΔmtnN，利用表3中相應(yīng)的引物擴增構(gòu)建T2(2)-oriΔmtnN的上下游同源臂，上下游同源臂大小分別為776 bp和784 bp，二者經(jīng)SOE-PCR融合后的產(chǎn)物大小為1 560 bp，上下游同源臂SOE-PCR融合片段與T2(2)-ori質(zhì)粒經(jīng)酶切和酶連后轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α，選取驗證正確的陽性轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒并用BamHI和XbaI酶切質(zhì)粒，電泳檢測結(jié)果如圖2所示，重組質(zhì)粒酶切片段大小與預(yù)期相符合，構(gòu)建好的敲除質(zhì)粒測序結(jié)果顯示正確，表明敲除質(zhì)粒T2(2)-oriΔmtnN構(gòu)建成功。

圖 2 重組質(zhì)粒T2(2)-oriΔmtnN雙酶切驗證Fig. 2 Identification of recombinant plasmid T2(2)-oriΔmtnN by double enzymatic digestion

將已構(gòu)建完成的重組質(zhì)粒T2(2)-oriΔmtnN電轉(zhuǎn)化至B. amyloliquefaciensHZ-12中，篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，并按照1.3.2節(jié)的方法進行單交換和雙交換篩選突變株。經(jīng)菌落PCR驗證正確的雙交換菌株，抽提其基因組DNA，并用ΔmtnN-YF和ΔmtnN-YR分別驗證陽性交換突變株和原始菌株B. amyloliquefaciensHZ-12，片段大小分別為1 965、2 681 bp，PCR驗證電泳圖如圖3所示，回收陽性交換突變株P(guān)CR產(chǎn)物經(jīng)測序確認堿基正確無誤。將構(gòu)建成功的缺失mtnN基因的菌株命名為HZ-12ΔmtnN。

圖 3 HZ-12ΔmtnN菌株的PCR電泳圖Fig. 3 Electrophoretogram of PCR-amplified products from strain HZ-12ΔmtnN

2.1.2 mtnN基因缺失對SAM含量的影響

為考察mtnN基因的缺失對B. amyloliquefaciens HZ-12合成SAM的影響，按照1.1.3節(jié)和1.3.4節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對工程菌株HZ-12ΔmtnN進行發(fā)酵驗證，發(fā)酵周期60 h。發(fā)酵結(jié)束后取樣檢測SAM產(chǎn)量和菌體生物量（OD600nm），結(jié)果如圖4所示。

圖 4 缺失mtnN基因?qū)AM產(chǎn)量及菌體生物量的影響Fig. 4 Effect of mtnN knockout on SAM yield and biomass

由圖4可以看出，工程菌HZ-12ΔmtnN的生物量相比于原始菌HZ12降低了26%，說明SAHN對菌體的生長有一定的作用，缺失后菌體的生長變緩。此外，工程菌 HZ-12ΔmtnN的SAM產(chǎn)量僅有4.54 mg/L，與原始菌HZ12相比降低了51%，這可能與菌體生長受阻有關(guān)。

2.2 反義RNA抑制mtnN基因表達對解淀粉芽孢桿菌SAM的影響

2.2.1 反義RNA抑制mtnN基因表達工程菌的構(gòu)建

為在不影響菌體生長繁殖的條件下，探索SAHN對B.amyloliquefaciensHZ-12合成SAM的影響。利用反義RNA技術(shù)抑制mtnN基因的表達，考察抑制SAHN對B. amyloliquefaciensHZ-12 SAM合成的影響。由于反義RNA的抑制效率與反義RNA在目標(biāo)基因5’端不翻譯區(qū)域結(jié)合位置有關(guān)，因此在mtnN基因5’端不翻譯區(qū)域選擇了不同的結(jié)合區(qū)域，結(jié)合長度分別為100、77 bp和144 bp，而基因編碼區(qū)域選擇的結(jié)合長度為100 bp。利用1.3.3節(jié)方法構(gòu)建重組載體pHY-mtnNasRNA-1、pHYmtnNasRNA-2和pHY-mtnNasRNA-3。以B. subtilis 168的基因組為模板，根據(jù)表3引物通過PCR擴增啟動子P43，大小為305 bp，通過引物mtnNasRNA-F和rrnB-R，以質(zhì)粒pUC19-mtnNasRNA為模板擴增目的片段和rrnB終止子，大小分別為200、250 bp，經(jīng)SOE-PCR融合后的產(chǎn)物大小為755 bp，SOE-PCR融合片段與質(zhì)粒pHY300經(jīng)酶切和酶連后轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α，轉(zhuǎn)化后得到質(zhì)粒pHYmtnNasRNA-1。通過引物mtnNasRNA-F和mtnNasRNA-2-R （mtnNasRNA-3-R），以質(zhì)粒pHY-mtnNasRNA-1為模板擴增，大小分別為177、244 bp，產(chǎn)物回收純化后與pHY-mtnNasRNA-1質(zhì)粒經(jīng)酶切和酶連后轉(zhuǎn)化至 E. coli DH5α。選取驗證正確的陽性轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒并用BamHI和XbaI酶切質(zhì)粒，電泳檢測結(jié)果如圖5所示，重組質(zhì)粒酶切片段大小與預(yù)期相符合，構(gòu)建好的質(zhì)粒測序結(jié)果顯示正確，表明pHY-mtnNasRNA-1、 pHY-mtnNasRNA-2和pHY-mtnNasRNA-3質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖 5 重組質(zhì)粒雙酶切驗證Fig. 5 Identification of recombinant plasmids by double enzymatic digestion

圖 6 重組菌株質(zhì)粒PCR驗證Fig. 6 PCR validation of plasmids from recombinant strains

將已構(gòu)建完成的重組質(zhì)粒pHY-mtnNasRNA-1、pHY-mtnNasRNA-2和pHY-mtnNasRNA-3電轉(zhuǎn)化至B. amyloliquefaciensHZ-12中，用引物pHY-F/pHY-R進行菌落PCR驗證，挑選正確的陽性克隆子進行質(zhì)粒DNA提取，通過PCR驗證（圖6），并測序進一步驗證，確認序列正確無誤，說明反義RNA抑制mtnN基因表達工程菌HZ-12/pHY-mtnNasRNA-1、HZ-12/pHY-mtnNasRNA-2和HZ-12/pHY-mtnNasRNA-3構(gòu)建成功。

2.2.2 反義RNA抑制mtnN基因表達對SAM含量的影響

研究表明，反義RNA能一定程度抑制某特定基因的表達，而菌體的生長繁殖不受影響。為驗證反義RNA抑制mtnN基因?qū). amyloliquefaciensHZ-12合成SAM的影響，按照1.1.3節(jié)和1.3.4節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對工程菌HZ-12/pHY-mtnNasRNA-1、HZ-12/pHY-mtnNasRNA-2和HZ-12/pHY-mtnNasRNA-3以及對照菌株HZ-12/pHY300和原始菌HZ-12進行發(fā)酵驗證，發(fā)酵周期60 h。并測定發(fā)酵終點的SAM產(chǎn)量和菌體生物量（OD600nm）。

圖 7 反義RNA抑制mtnN基因表達對SAM含量的影響Fig. 7 Effect of mtnN expression inhibition by asRNA on SAM production

由圖7可以看出，工程菌HZ-12/pHY-mtnNasRNA-1、HZ-12/pHY-mtnNasRNA-2和HZ-12/pHY-mtnNasRNA-3發(fā)酵后SAM產(chǎn)量分別為14.58、12.27 mg/L和12.49 mg/L， 相比于對照菌HZ-12/pHY300分別提高了44%、22%和24%，其中工程菌HZ-12/pHY-mtnNasRNA-1效果最明顯。由于反義RNA的抑制效率與反義RNA在目標(biāo)基因5’端不翻譯區(qū)域結(jié)合位置有關(guān)，所以在mtnN基因5’端不翻譯區(qū)域選擇不同的結(jié)合區(qū)域，對mtnN基因的抑制程度不同，從而影響SAM循環(huán)途徑，導(dǎo)致不同的SAM產(chǎn)量。而工程菌的生物量與對照菌相比沒有明顯差別，說明反義RNA抑制mtnN基因的表達既可促進SAM的積累，又不影響菌體的生長。

3 討 論

SAM是人體必需的生物活性輔因子，廣泛參與生物體內(nèi)各種代謝反應(yīng)，尤其是作為甲基供體參與生物體內(nèi)一百多種甲基轉(zhuǎn)移酶催化反應(yīng)[25-26]。mtnN基因同時參與SAM的兩個循環(huán)利用途徑，敲除或抑制該基因有望降低SAM的循環(huán)利用，促進SAM的積累。本研究基于基因敲除技術(shù)和反義RNA特異性抑制技術(shù)，成功構(gòu)建了mtnN基因缺失菌株HZ-12ΔmtnN以及抑制mtnN的反義RNA工程菌HZ-12/pHY-mtnNasRNA-1、HZ-12/pHY-mtnNasRNA-2和 HZ-12/pHY-mtnNasRNA-3。通過發(fā)酵驗證，發(fā)現(xiàn)缺失mtnN基因的菌株生長受到嚴(yán)重抑制，這與其他研究結(jié)果一致，SAHN在細胞內(nèi)具有重要作用，其活性的下降會造成胞內(nèi)SAH的累積，SAH是SAM依賴甲基轉(zhuǎn)移酶的反饋抑制劑，胞內(nèi)低濃度的SAH的積累就會使甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)得到全面抑制，從而嚴(yán)重影響細菌的生長和分裂[27]。同時，缺失菌株HZ-12ΔmtnN SAM產(chǎn)量僅有4.54 mg/L，與原始菌HZ12相比降低了51%，這可能是其菌體生長受阻造成的直接結(jié)果。

傳統(tǒng)的基因敲除方法可能會導(dǎo)致菌體生長受緩甚至死亡，而反義RNA介導(dǎo)的調(diào)控機制可以被用于代謝途徑的微調(diào)，常用于平衡細胞生長和產(chǎn)物的合成[28-30]。同樣，本研究所構(gòu)建的反義RNA抑制mtnN基因工程菌株，對菌體的生長沒有顯著的抑制作用。同時，工程菌的SAM產(chǎn)量相比于對照菌均有顯著的提高，特別是工程菌 HZ-12/pHY-mtnNasRNA-1，SAM的產(chǎn)量提高了44%。本研究通過反義RNA抑制技術(shù)精細調(diào)控mtnN基因，在不影響菌株生長的條件下，顯著增強了SAM的合成，為SAM生產(chǎn)菌的代謝工程育種提供了一種新型的策略。總體而言，目前從頭合成SAM的產(chǎn)率普遍較低。究其原因可能是目前微生物自身合成甲硫氨酸的能力普遍較弱，未來的研究需通過系統(tǒng)代謝工程改造強化菌株自身合成甲硫氨酸的能力，進一步提高SAM的產(chǎn)量。