西達本胺聯(lián)合苦參堿對皮膚T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系增殖、凋亡的影響及可能的凋亡機制

何杏蘭 王藝萌 王冠鈺 張春雷

北京大學(xué)第三醫(yī)院皮膚科 100191

皮膚T細(xì)胞淋巴瘤（cutaneous T-cell lymphoma，CTCL）是一種原發(fā)于皮膚的T細(xì)胞克隆增生性非霍奇金淋巴瘤。絕大多數(shù)CTCL病程較長，疾病發(fā)展緩慢，但目前尚缺乏治愈的方法［1］。西達本胺是我國自主研發(fā)合成的、擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的選擇性組蛋白去乙?；敢种苿╤istone deacetylase inhibitor，HDACi），在多種腫瘤的治療上顯示出良好的療效及低毒性［2］?？鄥A為中藥苦參的一種提取物，大量腫瘤細(xì)胞系及相關(guān)動物模型實驗均顯示其高抗腫瘤作用［3］。本研究旨在觀察西達本胺和苦參堿對CTCL細(xì)胞系HH和Hut78增殖、凋亡的影響，并通過進一步檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達，初步研究西達本胺聯(lián)合苦參堿治療CTCL的潛在機制。

材料與方法

一、細(xì)胞來源與試劑

HH細(xì)胞系（ATCC號CRL-2105），Hut78細(xì)胞系（ATCC號TIB-161），RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）、胎牛血清（美國HyClone公司），西達本胺（美國Selleck公司，目錄號S8567），苦參堿（中國科學(xué)院成都生物研究所），MTS細(xì)胞增殖檢測試劑盒（美國Promega公司），異硫氰酸熒光素-膜聯(lián)蛋白Ⅴ（FITC-AnnexinⅤ）凋亡檢測試劑盒（美國BD公司），兔抗人多克隆抗體胱天蛋白酶（caspase）3（美國Cell Signaling公司）、兔抗人多克隆抗體核因子（NF）κB p65、兔抗人單克隆抗體p-Bad、兔抗人單克隆抗體Bad、兔抗人單克隆抗體E鈣黏蛋白（cadherin）、兔抗人單克隆抗體Bcl-2、鼠抗人單克隆抗體GAPDH（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）。

將1 mg西達本胺粉末溶于2.5614 ml二甲基亞砜（DMSO）中配置為1 mmol/L儲存液，置-20℃保存，使用前采用DMSO稀釋至1 μmol/L。將100 mg苦參堿粉末溶于1 ml DMSO配置成100 g/L苦參堿液，-4℃保存。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

HH、Hut78細(xì)胞在含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)傳代，取對數(shù)生長期HH、Hut78細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

三、MTS法檢測西達本胺及苦參堿對HH、Hut78細(xì)胞增殖的影響

取對數(shù)生長期HH、Hut78細(xì)胞，計數(shù)后以2×104/ml接種于6孔板，每孔2 ml。實驗藥物濃度的選擇參考本課題組前期研究［4-5］和預(yù)實驗結(jié)果。2種細(xì)胞分別分為4組：西達本胺組（加入西達本胺使其終濃度為0.4 μmol/L）、苦參堿組（加入苦參堿使其終濃度為0.6 g/L）、聯(lián)合組（加入終濃度為0.4 μmol/L西達本胺溶液后立即加入0.6 g/L苦參堿溶液）、對照組（僅加入DMSO），分別培養(yǎng)24、48、72 h。每個時間點混勻細(xì)胞，取100 μl細(xì)胞懸液至96孔板中，每組做3個復(fù)孔，每孔加入20 μl預(yù)先配置的MTS溶液，37℃孵箱中培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測490 nm處吸光度（A值），重復(fù)測定3次。細(xì)胞增殖率 =［（A處理組-A培養(yǎng)基對照）/（A對照組-A培養(yǎng)基對照）］×100%。

四、流式細(xì)胞儀檢測西達本胺及苦參堿對HH、Hut78細(xì)胞凋亡率的影響

取對數(shù)生長期HH、Hut78細(xì)胞，以2×104/ml接種至6孔板中。按上述分4組，處理HH、Hut78細(xì)胞48 h。每組計數(shù)5×105細(xì)胞，冷磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞2次，1×106/ml細(xì)胞重懸于結(jié)合緩沖液中。取100 μl細(xì)胞懸液至5 ml培養(yǎng)管中，每管加入人FITC偶聯(lián)的AnnexinⅤ5 μl以及碘化丙錠5 μl?；靹颍芄夥跤?5 min。每管加入400 μl結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。以上實驗重復(fù)3次。細(xì)胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

五、Western印跡法檢測西達本胺及苦參堿對HH、Hut78細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

HH、Hut78細(xì)胞按上述分組處理48 h后，取106個細(xì)胞，離心后棄上清液，磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞2次，加入蛋白裂解液并置于冰上，混勻。4℃震蕩孵育1 h，4℃18 000×g離心15 min。收集上清液，用二喹啉甲酸（BCA）法蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。總蛋白溶液中加入蛋白電泳上樣緩沖液，充分混勻，水浴鍋中100℃煮沸變性5 min。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠每孔分別加入30 μg總蛋白或2 μl預(yù)染色蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)志（marker），90 V恒壓40 min，蛋白進入分離膠后，130 V恒壓電泳90 min。250 mA 90 min將電泳蛋白電轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入目的蛋白一抗：兔抗人多克隆抗體caspase-3（1∶1 000）、兔抗人多克隆抗體NF-κB p65（1∶1 000）、兔抗人單克隆抗體p-Bad（1∶1 000），兔抗人單克隆抗體Bad（1∶1 000），兔抗人單克隆抗體E-cadherin（1∶10 000），兔抗人單克隆抗體Bcl-2（1∶1 000），搖床上4℃過夜。封閉洗滌緩沖液（TBST）洗滌3次，每次15 min，加入IRDye?800CW染料標(biāo)記的山羊抗兔二抗或山羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，每次15 min。雙紅外激光掃描成像系統(tǒng)進行熒光顯色、分析。以GAPDH為內(nèi)參，使用Image J軟件定量分析各條帶灰度值。

六、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、西達本胺和苦參堿對HH、Hut78細(xì)胞體外增殖的影響

與對照組相比，西達本胺組、苦參堿組和聯(lián)合組HH、Hut78細(xì)胞增殖率均有不同程度降低，見圖1。HH細(xì)胞系重復(fù)測量方差分析顯示，各處理組細(xì)胞增殖率有隨時間變化的趨勢（F=137.41，P＜0.001），且不同處理組間細(xì)胞增殖率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=15.88，P＜0.05）。各處理組間兩兩比較顯示，24 h時，聯(lián)合組細(xì)胞增殖率與苦參堿組和西達本胺組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（LSD-t=1.84、3.12，P=0.12、0.21）；48、72 h時，聯(lián)合組細(xì)胞增殖率顯著低于苦參堿組（LSD-t=4.90、2.64，均P＜0.05）和西達本胺組（LSD-t=4.89、6.32，均P ＜0.05）。

Hut78細(xì)胞系各處理組細(xì)胞增殖率有隨時間變化的趨勢（F=138.69，P ＜0.001），且不同處理組間細(xì)胞增殖率差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（F=558.26，P ＜ 0.001）。各處理組間兩兩比較顯示，24、48、72 h時，聯(lián)合組細(xì)胞增殖率均顯著低于苦參堿組（LSD-t=2.60、10.18、14.93，均P ＜ 0.05）和西達本胺組（LSD-t=6.56、4.86、4.71，均P ＜ 0.05）。見圖1。

圖1 西達本胺和苦參堿單藥或聯(lián)合處理對HH、Hut78細(xì)胞增殖活力的影響 西達本胺、苦參堿單藥或聯(lián)合處理均使HH、Hut78細(xì)胞增殖率有不同程度降低，且各處理組細(xì)胞增殖率有隨時間延長逐漸降低的趨勢。24 h時，各處理組間HH細(xì)胞增殖率無明顯差異，但48、72 h時聯(lián)合組低于苦參堿組和西達本胺組；24、48、72 h時，聯(lián)合組Hut78細(xì)胞增殖率均低于苦參堿組和西達本胺組

二、西達本胺和苦參堿對HH、Hut78細(xì)胞凋亡的影響

48 h時，西達本胺組、苦參堿組、聯(lián)合組和對照組HH細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=10.22，P＜0.05）。兩兩多重比較顯示，苦參堿組、西達本胺組與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（LSD-t=1.97、1.69，P=0.20、0.27），苦參堿組與西達本胺組相比差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（LSD-t=0.29，P=0.84），但聯(lián)合組顯著高于對照組、苦參堿組和西達本胺組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（LSD-t=7.37、5.40、5.69，均P ＜ 0.05）。見圖2、表1。

西達本胺組、苦參堿組、聯(lián)合組和對照組Hut78細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=32.36，P＜0.05）。兩兩比較顯示，苦參堿組、西達本胺組和聯(lián)合組均顯著高于對照組（LSD-t=4.76、5.31、13.69，均P＜0.05），且聯(lián)合組仍顯著高于苦參堿組和西達本胺組（LSD-t=8.93、8.37，均P ＜ 0.01）。見圖2、表1。

三、西達本胺和苦參堿對HH、Hut78細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

圖2 流式細(xì)胞儀檢測西達本胺、苦參堿單藥或聯(lián)合對HH、Hut78細(xì)胞凋亡的影響 48 h時，聯(lián)合組HH細(xì)胞凋亡率高于對照組、苦參堿組和西達本胺組，而對照組、苦參堿組和西達本胺組間無明顯差異；苦參堿組、西達本胺組和聯(lián)合組Hut78細(xì)胞凋亡率均高于對照組，且聯(lián)合組高于苦參堿組和西達本胺組

表1 西達本胺、苦參堿單藥或聯(lián)合對HH、Hut78細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響（±s）

表1 西達本胺、苦參堿單藥或聯(lián)合對HH、Hut78細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響（±s）

注：a與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。caspase-3：胱天蛋白酶3

組別 細(xì)胞凋亡率（%） 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達E鈣黏蛋白p65Bad p-Bad Bcl-2caspase-3剪切體HH細(xì)胞系對照組苦參堿組西達本胺組聯(lián)合組F值P值Hut78細(xì)胞系對照組苦參堿組西達本胺組聯(lián)合組F值P值11.44±1.43 13.98±3.86 13.61±1.62 20.94±0.64a 10.22＜0.05 2.06±0.27 1.61±0.23 1.28±0.10a 0.76±0.12a 24.83＜0.05 2.90±0.47 2.74±0.53 2.72±0.56 1.46±0.24a 6.196＜0.05 2.89±0.86 2.96±0.72 2.64±0.60 2.76±0.70 0.11 0.95 1.50±0.11 1.27±0.09 1.16±0.19 0.83±0.06a 12.64＜0.05 3.68±0.49 3.12±0.33 2.90±0.19 2.06±0.09a 13.71＜0.05 0.77±0.14 0.79±0.16 0.90±0.04 1.27±0.17a 8.58＜0.05 8.42±4.23 20.98±1.53a 22.44±7.74a 44.53±1.85a 32.36＜0.05 3.91±0.23 3.11±0.49a 2.63±0.23a 1.78±0.43a 22.08＜0.05 3.34±0.20 2.56±0.18a 2.53±0.36a 1.46±0.34a 22.15＜0.05 2.72±0.39 2.44±0.32 2.15±0.22 2.10±0.09 2.78 0.11 1.97±0.18 1.23±0.35a 1.26±0.16a 0.49±0.28a 16.64＜0.05 1.25±0.07 0.94±0.12a 0.79±0.17a 0.32±0.10a 30.67＜0.05 1.02±0.15 1.37±0.05 1.48±0.14a 2.09±0.17a 32.63＜0.05

圖3 Western印跡法檢測西達本胺、苦參堿單藥或聯(lián)合對HH、Hut78細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 苦參堿、西達本胺單藥或聯(lián)合處理48 h后，Hut78細(xì)胞caspase-3剪切體蛋白表達有不同程度升高，而E鈣黏蛋白（cadherin）、p65、p-Bad、Bcl-2蛋白表達有不同程度降低，Bad蛋白表達基本無差異；HH細(xì)胞聯(lián)合組caspase-3剪切體蛋白表達明顯升高，而E-cadherin、p65、p-Bad、Bcl-2蛋白表達明顯降低，4組間Bad蛋白表達無明顯差異

如圖3、表1所示，HH細(xì)胞中，聯(lián)合組caspase-3剪切體蛋白表達顯著高于對照組、苦參堿組和西達本胺組（LSD-t=6.37、5.98、4.67，均P ＜ 0.05），而E-cadherin（LSD-t=11.82、7.80、4.78）、p65（LSD-t=5.36、4.76、4.12）、p-Bad（LSD-t=9.70、6.35、4.84）及Bcl-2蛋白（LSD-t=8.92、5.84、4.64）表達顯著低于其他3組（均P＞0.05）。4組間Bad蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與對照組相比，苦參堿組、西達本胺組caspase-3剪切體蛋白、p65、p-Bad和Bcl-2蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），且苦參堿組E-cadherin蛋白表達差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（LSD-t=4.02，P=0.08），而西達本胺組E-cadherin蛋白表達顯著低于對照組（LSD-t=7.036，P ＜ 0.05）。

Hut78細(xì)胞中，苦參堿組、西達本胺組和聯(lián)合組E-cadherin（LSD-t=4.57、6.97、11.75）、p65（LSD-t=4.74、4.94、11.46）、p-Bad（LSD-t=5.01、4.76、9.99）、Bcl-2蛋白（LSD-t=4.55、6.65、13.47）表達均顯著低于對照組（均P＜0.05）?？鄥A組caspase-3剪切體蛋白表達與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（LSD-t=4.50，P＞0.05），而西達本胺組和聯(lián)合組顯著高于對照組（LSD-t=5.90、13.72，均P ＜ 0.05），聯(lián)合組顯著高于苦參堿組和西達本胺組（LSD-t=9.22、7.82，均P ＜ 0.05）。聯(lián)合組E-cadherin、p65、p-Bad、Bcl-2蛋白表達顯著低于苦參堿組（LSD-t=7.18、6.72、4.98、8.92，均 P ＜ 0.05）和西達本胺組（LSD-t=4.78、6.52、5.19、6.82，均P ＜ 0.05）。4組間Bad蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

討 論

CTCL是一組表現(xiàn)多樣的結(jié)外霍奇金淋巴瘤，雖然其治療方法多樣，但并無完全治愈的方法，因此探索具有更好療效的藥物至關(guān)重要［6］。組蛋白去乙酰化酶（HDAC）與許多腫瘤發(fā)生有強相關(guān)性，目前已成為腫瘤研究的熱點方向。其抑制劑HDACi可通過抑制細(xì)胞周期和DNA修復(fù)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方式抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，在腫瘤治療方面顯示出極大的潛力［7］。西達本胺是我國自主研發(fā)合成的選擇性HDACi，能選擇性抑制HDAC-1、2、3、10，毒性低，并被證實對多種腫瘤均有良好的治療效果［2］。一項西達本胺治療79例難治性、復(fù)發(fā)性皮膚外周T細(xì)胞淋巴瘤患者的Ⅱ期臨床試驗顯示，治療后患者中位生存時間提高，可達21.4個月［8］。西達本胺對CTCL也有明顯抗腫瘤療效，一項西達本胺治療難治性CTCL患者的Ⅱ期臨床試驗顯示，連續(xù)給藥組總緩解率可達36%，且不良反應(yīng)少［9］。本課題組前期研究［4］顯示，西達本胺作用于CTCL細(xì)胞系可明顯抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。苦參堿是一種豆科類植物苦參的提取物，具有良好的藥理學(xué)活性。既往研究表明［3，10］，苦參堿在多種腫瘤的治療上都有著良好的療效，并顯示出巨大的潛力。我們前期研究［5］顯示，苦參堿能有效抑制CTCL細(xì)胞系HH增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

我們采用西達本胺、苦參堿單藥或二者聯(lián)合體外干預(yù)人CTCL細(xì)胞系HH和Hut78，研究西達本胺和苦參堿對腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡的影響。結(jié)果顯示，西達本胺與苦參堿二者聯(lián)合能顯著抑制HH和Hut78細(xì)胞增殖并促進其凋亡。Western印跡結(jié)果顯示，經(jīng)西達本胺、苦參堿單藥或聯(lián)合處理HH和Hut78兩個細(xì)胞系后，E-cadherin蛋白表達明顯下調(diào)，而caspase 3剪切體的表達上調(diào)。E-cadherin是相對分子量為120 000的糖蛋白，大多分布于上皮細(xì)胞表面，目前有研究［11］發(fā)現(xiàn)，E-cadherin也可高表達于一些非霍奇金淋巴瘤的腫瘤細(xì)胞上。在多種腫瘤中，E-cadherin不僅對細(xì)胞間粘附發(fā)揮作用，也對凋亡的發(fā)生起關(guān)鍵作用。Galaz等［12］研究認(rèn)為，E-cadherin的表達減少是誘導(dǎo)凋亡的一個重要觸發(fā)點。E-cadherin表達下調(diào)能直接激活caspase-3，caspase-3激活后產(chǎn)生caspase-3剪切體從而執(zhí)行細(xì)胞凋亡［13］。在尤因肉瘤、肝癌等多種腫瘤［14-16］中，E-cadherin表達下調(diào)可促進腫瘤細(xì)胞凋亡。結(jié)合既往文獻報道，本研究結(jié)果提示，西達本胺聯(lián)合苦參堿可能也通過抑制E-cadherin，激活caspase-3，產(chǎn)生caspase-3剪切體，從而誘導(dǎo)Hut-78、HH細(xì)胞凋亡。

Bad屬于Bcl-2家族一員，是一種僅含BH3區(qū)域蛋白的促凋亡分子，Bad促凋亡作用由其絲氨酸磷酸化調(diào)控。細(xì)胞質(zhì)中，磷酸化Bad與一種支架蛋白14-3-3結(jié)合，而無法與抗凋亡蛋白Bcl-2形成二聚體，進而無法發(fā)揮促凋亡作用；一旦細(xì)胞受到刺激，Bad立即去磷酸化，遷移至線粒體中與抗凋亡分子Bcl-2相結(jié)合形成復(fù)合體，從而抑制Bcl-2抗凋亡作用而誘導(dǎo)凋亡［17-18］。NF-κB是一種極為重要的介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子，其與細(xì)胞凋亡發(fā)生也有密切關(guān)聯(lián)。既往研究［19］顯示，CTCL中NF-κB的激活與腫瘤細(xì)胞存活有明顯正相關(guān)性。多種腫瘤研究［20-22］表明，抑制NF-κB的表達能下調(diào)Bcl-2蛋白的表達水平，通過激活下游caspase-3等分子而引發(fā)凋亡級聯(lián)反應(yīng)，從而起到抑制腫瘤生長的作用。Bcl-2與Bad一樣，同屬于Bcl-2蛋白家族，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮不容忽視的作用。目前最主流的Bcl-2調(diào)節(jié)凋亡模型認(rèn)為，Bcl-2能與Bcl-2家族中其他促凋亡蛋白緊密結(jié)合，從而抑制細(xì)胞色素c的釋放而使后續(xù)的凋亡級聯(lián)反應(yīng)無法進行［23-24］。本研究顯示，西達本胺、苦參堿單藥或聯(lián)合處理HH、Hut78細(xì)胞后均可抑制p-Bad、p65、Bcl-2的表達。結(jié)合上述文獻我們認(rèn)為，西達本胺和苦參堿可能通過抑制p-Bad與NF-κB的表達，進一步干擾Bcl-2的表達，促進凋亡發(fā)生。

西達本胺或苦參堿單藥對多種腫瘤作用機制的研究［25-28］顯示，兩藥皆可通過下調(diào)Bcl-2、p65蛋白表達水平，進一步激活下游的caspase-3蛋白，從而抑制多種腫瘤生長。本研究結(jié)果顯示，與單藥組相比，西達本胺聯(lián)合苦參堿對HH、Hut78細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用更明顯，對凋亡相關(guān)蛋白caspase-3剪切體表達的升高及E-cadherin、p65、p-Bad、Bcl-2表達的降低作用均明顯強于單藥組，顯示西達本胺聯(lián)合苦參堿能協(xié)同抑制HH、Hut78細(xì)胞的生長?？赡芪鬟_本胺與苦參堿在誘導(dǎo)CTCL細(xì)胞系凋亡的作用機制上有所重疊，聯(lián)合用藥比單藥處理效果更加顯著。與Hut78細(xì)胞上有白細(xì)胞介素（IL）-2受體全鏈相比，HH細(xì)胞僅有IL-2受體β + γ鏈［29-30］，對IL-2的親和力要低于Hut78細(xì)胞。IL-2可通過激活JAK1和JAK3激酶參與CTCL的發(fā)生，而抑制IL-2能抑制信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白5（STAT5），從而抑制抗凋亡蛋白的產(chǎn)生，進而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［31］?？鄥A和HDACi均能抑制IL-2的產(chǎn)生［32-33］。因此，我們推測苦參堿和西達本胺誘導(dǎo)HH細(xì)胞凋亡的作用不如Hut78細(xì)胞。

西達本胺聯(lián)合苦參堿處理CTCL細(xì)胞系，可能通過抑制E-cadherin蛋白表達而激活caspase-3、產(chǎn)生caspase-3剪切體，從而促進凋亡，或通過抑制p65、p-Bad蛋白表達而干擾Bcl-2蛋白的表達，進而激活caspase-3，產(chǎn)生caspase-3剪切體，從而促進凋亡。本研究中我們僅對HH、Hut78兩個細(xì)胞系進行了初步研究，后續(xù)將探索更多細(xì)胞系或進行動物實驗，深入研究西達本胺與苦參堿聯(lián)合作用于CTCL的機制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突