熊蜂SMRTER蛋白多克隆抗體的制備

徐偉林 孫成

（中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所，北京 100093）

熊蜂是重要的傳粉昆蟲，在促進農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及維護生態(tài)系統(tǒng)平衡等發(fā)面發(fā)揮重要作用[1，2]。熊蜂的地理分布范圍非常廣泛，從格林蘭島到亞馬遜平原；它們的棲息地種類多樣，從高山草甸到熱帶雨林[3]。到目前為止，人們不清楚是什么分子機制導致了熊蜂具有如此廣泛的分布能力。對于這一問題的了解有助于更好地利用熊蜂進行授粉服務，也有利于采取恰當?shù)拇胧π芊溥M行保護。串聯(lián)重復序列（tandem repeat）是基因組中高度變異的遺傳元件。我們通過對兩種基因組已經(jīng)測序的熊蜂進行比較發(fā)現(xiàn)，串聯(lián)重復序列的變異很可能為熊蜂的環(huán)境適應提供了良好的遺傳變異素材[4]。我們的研究也鑒定出101個編碼區(qū)含有串聯(lián)重復序列的熊蜂基因，基因中串聯(lián)重復序列的變異引起它們所編碼蛋白質(zhì)序列長度的變化。Smr基因就是這些基因之一。

Smr基因編碼一個異常大的、由3604個氨基酸組成的SMRTER（SMRT-related and ecdysone receptor interacting factor）蛋白，是一種在真核細胞中表達并且在進化上高度保守的轉錄因子[5]。SMRTER[6]不僅對ecdysone通路有抑制作用，而且對卵泡細胞和翅膀的Notch通路也有抑制作用。Smr基因的突變會導致果蠅存在以下缺陷：翅膀和腿變形、產(chǎn)卵形態(tài)缺陷、生殖力下降[5]。

本研究旨在利用基因合成技術獲得熊蜂Smr基因的編碼區(qū)，并把其克隆進大腸桿菌表達載體。在IPTG的誘導下表達SMRTER重組蛋白，并對表達出的可溶性蛋白進行純化。制備兔抗SMRTER多克隆抗體，并檢驗所制備的多克隆抗體的特異性。該研究為進一步研究Smr基因在熊蜂中的生物學功能奠定基礎，也有利于研究該基因中串聯(lián)重復序列所導致的蛋白質(zhì)長度變化是否會影響該蛋白的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑

Ezfusion同源重組酶購自上海捷瑞生物工程有限公司，DNA回收試劑盒購自天根生化科技有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒品牌為Axygen，感受態(tài)細胞類型為TOP10，親和層析柱料購自武漢匯研生物科技有限公司，酶標二抗品牌為Jackson，TMB購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 基因合成

通過基因合成的方式合成Smr基因的編碼區(qū)，由多條引物序列合成，擴增引物序列信息見表1（由武漢金開瑞生物科技有限公司合成）。

1.3 基因擴增

PCR擴增反應體系為正反引物各1μl（10pmol），模板1μl（20～50ng），5μl 10* pfu buffer，pfu DNA聚合酶1μl（5U），補去離子水至50μl，PCR擴增反應條件見表2。

2 載體與目的基因的連接與轉化

取Pet-b2m載體（該載體為武漢金開瑞生物科技有限公司改造）50ng，目的基因150ng，Ezfusion同源重組酶2μl，T4 DNA Ligase 1μl，補去離子水至20μl，在16℃條件下孵育1h進行連接。

表1 引物序列信息

表2 基因擴增PCR反應條件

將載體與目的基因連接的產(chǎn)物加入到裝有TOP10感受態(tài)細胞的管中（50μl感受態(tài)細胞需要25ng DNA），輕輕旋轉幾次混勻內(nèi)容物，冰浴30min；將離心管混合物放入加溫至42℃的循環(huán)水中，熱激90s；快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1～2min；每管加入200μl SOC液體培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫至37℃，然后將管轉移到設置為37℃的搖床上，220rpm培養(yǎng)45min，使細胞復蘇并表達質(zhì)粒編碼的抗性標記基因；將適當體積（每個90mm平板達200μl）已轉化的感受態(tài)細胞轉移到含有相應抗生素的LB培養(yǎng)基上；倒置平板，于37℃培養(yǎng)，12～16h后可出現(xiàn)菌斑。

2.1 菌落PCR驗證

待平板上長出菌落，隨機挑取若干個，進行菌落PCR驗證，檢測轉化。

2.2 測序驗證

陽性克隆由武漢金開瑞生物工程有限公司測序平臺測序驗證。

3 SMRTER蛋白的誘導表達及純化

3.1 陽性克隆小量表達與鑒定

挑選含重組質(zhì)粒的單菌落至3ml LB液體培養(yǎng)基（卡那抗性）中，37℃培養(yǎng)過夜后-20℃保種；分別挑選含重組質(zhì)粒的單菌落至3ml LB液體培養(yǎng)基（卡那抗性）中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600約0.6；取部分菌液作為對照組，余下菌液加入IPTG誘導劑（終濃度1mM），37℃震蕩培養(yǎng)3h；分別取兩組菌液0.15ml，12000×g離心2min，菌體沉淀以40μl 1×loading buffer重懸裂解，SDS-PAGE檢測。

3.2 蛋白大量表達及破菌檢測

取保存于-20℃的菌種100μl接種于100ml LB液體培養(yǎng)基（卡那抗性）中震蕩培養(yǎng)過夜；取100ml菌液接種于2000ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃擴大培養(yǎng)至OD600約0.6，降低培養(yǎng)溫度到30℃；加入IPTG誘導劑至終濃度0.5mM，30℃繼續(xù)震蕩培養(yǎng)8h；8000rpm離心3min收集菌體，重懸于50ml預冷NTA-0緩沖液中，冰浴30min；超聲破碎菌體，參數(shù)設置為功率200W、工作3s、暫停4s、時間25～30min；16000rpm 4℃離心50min，收集上清以及沉淀；取少量上清及沉淀進行SDS-PAGE檢測，剩余上清及沉淀置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

3.3 包涵體蛋白純化

沉淀以50ml NTA-0緩沖液重懸，加入DTT至終濃度1mM；超聲促進雜蛋白溶解，參數(shù)設置為功率200W、工作3s、暫停3s、時間10min；10000rpm 4℃離心10min，去上清；重復以上三步至上清透明；沉淀以PBS重懸，超聲，參數(shù)設置為功率200W、工作3s、暫停3s、時間5min；16000rpm 4℃離心10min，去上清；以3ml 6M鹽酸胍重懸包涵體，加DTT至終濃度5mM；220rpm 37℃震蕩3h至包涵體全部溶解；10000rpm 4℃離心10min，取上清。取蛋白溶液進行SDS-PAGE檢測。

3.4 包涵體蛋白復性

以2倍體積的3M鹽酸胍稀釋蛋白溶液，在4℃環(huán)境下以注射器逐滴加入到200ml復性液（pH 8.0）中，轉速調(diào)節(jié)至最大，攪拌24h；降低轉速，攪拌24h；取蛋白溶液于透析袋中，以PEG20000濃縮體積至50～100ml；4℃ TE緩沖液透析過夜；取蛋白溶液，以PEG20000濃縮體積至2～4ml；4℃ TE緩沖液透析過夜。

3.5 復性蛋白純化

上清蛋白溶液用0.22μm過濾器過濾備用；準備Ni-NTA柱；以1ml/min的流速上樣上清蛋白溶液；以NTA-0緩沖液（pH 8.0）洗柱至流出液不含蛋白（G250檢測液不變色）；分別以20mM、60mM、200mM和500mM咪唑洗脫，分段收集洗脫液至G250檢測液不變色；以3倍柱體積去離子水洗滌柱料，以20%乙醇封柱；對收集的洗脫液進行SDS-PAGE電泳檢測。

4 SMRTER多克隆抗體的制備與純化

將純化的SMRTER蛋白混入弗氏佐劑免疫健康狀態(tài)良好的實驗兔，免疫程序：一免，抗原+完全弗佐+PBS，皮下注射，400ug（抗原）/只，反應時間2周；二免，抗原+完全弗佐+PBS，皮下注射，400ug（抗原）/只，反應時間2周；三免，抗原+完全弗佐+PBS，皮下注射，400ug（抗原）/只，反應時間2周（效價檢測，見ELISA效價檢測操作記錄）；四免，抗原+不完全弗佐+PBS，皮下，400ug（抗原）/只，反應時間1周（效價檢測，見ELISA效價檢測操作記錄）。共免疫2只日本大耳白兔子：兔子編號分別為G872、G873；G872、G873兔子免疫原都為SMRTER重組蛋白，免疫次數(shù)共4次。

純化：層析柱預處理，10倍柱床體積的去離子水沖洗3～5遍，流速1ml/min，10倍柱體積的0.02M PB+0.3M NaCl 沖洗3～5遍，流速1ml/min；樣品上樣，10ml抗血清/腹水，用0.02M PB稀釋后，0.22um濾器過濾后上柱，調(diào)整流速為5～7s/滴；洗雜，0.02M PB沖洗至檢測（G250不變藍）無蛋白流出為止，流速2s/滴；抗體洗脫，0.1M PH=3.0甘氨酸以3～5s/滴過柱洗脫，收集洗脫物并用G250檢測洗脫產(chǎn)物至不變藍為止；PH值調(diào)節(jié)，飽和碳酸鈉調(diào)節(jié)洗脫產(chǎn)物PH至中性；超濾濃縮，10kDa超濾管，超濾濃縮至1～3ml左右；透析，5L，0.01M PH=7.4 PBS透析過夜，第二天換液1次后再透析4～6h左右后跑SDS膠并測定抗體濃度后裝入標記好EP管，可暫存于4℃?zhèn)溆没蛑苯颖４嬗?20℃；層析柱洗滌與貯存，去離子水沖洗層析柱，5倍柱床體積20%乙醇沖洗層析柱后，4℃封存。

5 多克隆抗體特異性檢測

間接ELISA法，通過對抗體的梯度稀釋，直觀反映了抗體的效價和靈敏度?？乖唬河冒灰合♂尶乖?μg/ml，100μl/孔加入96孔酶標反應板中，4℃過夜包被；洗滌：次日棄掉孔內(nèi)的液體，洗滌液洗3次；封閉：加200μl/孔封閉液，37℃溫育2h；洗滌：用洗滌液洗 3 次；加待測樣品（一抗）：加入抗血清（取血4℃ 4000rmp 離心10min取上清），用稀釋液將血清按1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000......進行倍比稀釋（空白血清同比稀釋做陰性對照），每孔100μl，37℃孵育1h；洗滌：用洗滌液洗3次；加酶標抗抗體：加入HRP標記IgG二抗，100μl/孔，37℃孵育40min（羊抗小鼠-HRP 1:10000～1:5000，羊抗兔-HRP 1:10000～1:5000）。洗滌：用洗滌液洗5次后拍干；顯色：加新鮮配制的底物溶液100μl/孔，37℃遮光放置5～20min；終止反應、比色：加50μl/孔終止液，顏色變黃；用酶標儀測定450nm處各孔的吸光值。

6 結果

6.1 表達載體的構建

將Smr基因的編碼序列插入表達載體、轉化細菌后，挑選具有抗生素抗性的陽性菌株進行質(zhì)粒提取，并對質(zhì)粒上目的基因插入?yún)^(qū)域進行了測序。測序結果表明：目的基因已經(jīng)正確地插入到表達載體之中。測序結果如下：

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圖1 目的基因小量表達后的SDS-PAGE電泳檢測

6.2 Smr基因的小量表達

我們使用IPTG進行誘導，對Smr基因進行小量表達實驗，以查看目的基因是否能夠成功表達。結果顯示：與沒有加IPTG誘導劑的全細菌蛋白相比，加誘導劑的全菌蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測后，在目的大?。?2kDa）處出現(xiàn)明顯的目的蛋白條帶（圖1）。因此，我們所構建的表達載體能夠使Smr基因成功表達。

6.3 Smr基因的大量表達

對大腸桿菌進行大量培養(yǎng)并加入IPTG誘導劑誘導表達。超聲破碎菌體并離心后，分別取少量上清及沉淀進行SDS-PAGE檢測。結果顯示，該基因大量表達后，產(chǎn)生的目的蛋白（即SMRTER）主要以包涵體的形式存在（圖2）。

圖2 目的基因大量表達后的SDS-PAGE電泳圖

6.4 SMRTER包涵體蛋白的復性與純化

我們對包涵體蛋白進行了復性，并使用Ni-NTA柱對復性的蛋白進行了純化。取少量純化后的蛋白洗脫液進行SDS-PAGE電泳檢測，結果顯示：通過對包涵體進行復性、純化，我們得到了高質(zhì)量的目的蛋白（圖3）。

6.5 SMRTER蛋白多克隆抗體的制備及特異性檢測

通過4次免疫家兔，我們獲得了SMRTER蛋白的多克隆抗體；我們對抗體進行了收集與純化，并使用如下兩種方法對獲得的多克隆抗體進行檢測：

圖3 目的蛋白復性純化后的SDS-PAGE電泳檢測

檢測方法1：間接ELISA法。通過對抗體進行梯度稀釋，直觀反映了抗體的效價和靈敏度。當稀釋比例為9.8ng/ml，酶標儀測定450nm處的吸光值檢測為0.1915，結果符合預期（圖4）。

圖4 SMRTER蛋白的多克隆抗體的效價檢測結果

檢測方法2：Western blotting（WB）雜交印記法。重組抗原的WB檢測中，在約62kDa處有特異性識別，條帶相對單一，這表明我們得到了特異性的抗體（圖5）。

7 討論

本研究利用基因合成技術獲得熊蜂Smr基因的編碼序列，并將其克隆進細菌表達載體；在0.5mmol/l IPTG誘導下表達了SMRTER重組蛋白，并對表達出的蛋白進行了純化；成功制備了兔抗SMRTER多克隆抗體，并且制備的SMRTER多克隆抗體具有很好的效價和特異性。

圖5 SMRTER蛋白的多克隆抗體的WB雜交檢測結果

本研究所制備的SMRTER多克隆抗體為研究Smr基因在熊蜂中的生物學功能奠定了基礎。另外，由于該基因中串聯(lián)重復序列的變異導致熊蜂種間該基因所編碼蛋白質(zhì)序列的長度發(fā)生變異，因而本研究所制備的抗體也有利于研究串聯(lián)重復序列所產(chǎn)生的突變對蛋白質(zhì)功能的影響。