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      SBA-15固定化漆酶及其穩(wěn)定性研究

      2020-04-07 09:59:28
      山東化工 2020年5期
      關(guān)鍵詞:漆酶分子篩緩沖液

      夏 峰

      (南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院,江蘇 連云港 222000)

      酶催化具有高效、專一、作用條件溫和及環(huán)境友好等顯著特點(diǎn),因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、食品、輕工和環(huán)境保護(hù)等行業(yè)[1]。雖然酶具有如此優(yōu)越的性能,但游離酶穩(wěn)定性差、不易分離、難于回收,因而其應(yīng)用受到一定限制,而酶的固定化可以很好的解決這一問題,使其具有更廣闊的應(yīng)用空間[2-4]。漆酶是含有四個銅離子的多酚氧化酶,屬單電子氧化還原酶,來源廣泛,具有相當(dāng)寬泛的底物專一性和較好的穩(wěn)定性,被廣泛應(yīng)用于生物漂白、廢水處理、有機(jī)合成、燃料電池、生物傳感器構(gòu)建和藥物生產(chǎn)等方面[5-8]。SBA-15是一種水熱穩(wěn)定性高,孔徑大的介孔材料,對于固定大分子的酶具有一定優(yōu)勢[9-10]。本文以大孔徑SBA-15為載體,通過吸附漆酶制備了一種固定化漆酶,該固定化漆酶表現(xiàn)出良好的操作穩(wěn)定性,具有一定應(yīng)用價值。

      1 儀器與試劑

      1.1 儀器

      pH計,準(zhǔn)微量天平,水平搖床,離心機(jī),Biomate 3S紫外分光光度計。

      1.2 試劑

      磷酸二氫鈉·二水,磷酸氫二鈉·十二水,2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(以下簡稱ABTS),漆酶,SBA-15分子篩。

      2 實(shí)驗(yàn)方法

      2.1 漆酶的固定化

      將0.05 g的SBA-15(BET比表面積≥800 m2/g,孔徑 6~10 nm)分子篩懸浮于5 mL含有一定濃度漆酶的0.2 mol/L磷酸緩沖液中,在水平搖床上以160 r/min的轉(zhuǎn)速反應(yīng)20 h,然后離心分離出固體,并用磷酸緩沖液洗滌固體至上清液中檢測不到酶活,即得到需要的固定化漆酶。

      2.2 酶活性的測定

      游離漆酶活性的測定:以1.0 mmol/L的ABTS溶液為底物,取一定濃度的漆酶溶液與ABTS溶液進(jìn)行等體積反應(yīng),反應(yīng)體系為適當(dāng)pH值的0.2 mol/L磷酸緩沖液,然后用Biomate 3S紫外分光光度計測定反應(yīng)體系4 min內(nèi)420 nm處的吸光度變化,吸光度變化越大,酶活越高,每分鐘使1 μmol的ABTS氧化所需的酶量定義為一個酶活單位。

      固定化漆酶活性的測定:取0.05 g固定化漆酶,加入2 mL適當(dāng)pH值的0.2 mol/L磷酸緩沖液和1 mL 1.0 mmol/L的ABTS溶液,反應(yīng)5 min后置于冰水浴中停止反應(yīng),離心分離,測上清液在420 nm處的吸光度,每克載體每分鐘使1 μmol的ABTS氧化所需的酶量定義為一個酶活單位。

      3 結(jié)果與討論

      3.1 游離漆酶的最適pH值及pH穩(wěn)定性

      圖1是不同pH值下游離漆酶催化ABTS反應(yīng)體系的吸光度變化隨時間的變化關(guān)系,由于酶活性與吸光度變化值成正比,所以吸光度變化越大,酶活越高。從圖1可以看到,反應(yīng)體系的吸光度值隨著反應(yīng)時間的進(jìn)行不斷增大,但不同pH值下吸光度的變化速度不同,當(dāng)pH值為3時,反應(yīng)體系的吸光度值變化最快,說明此時漆酶的活性最高,所以游離漆酶的最適pH值為3左右。

      圖1 pH值對漆酶活性的影響

      將游離漆酶在pH值為2~6的磷酸緩沖液中分別放置20 h后,測定酶的剩余活性,即可表示漆酶在不同pH值下的穩(wěn)定性,結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看到,放置20 h后,與新鮮漆酶的活性相比,反應(yīng)體系4 min后的吸光度值,即漆酶活性均發(fā)生了一定的變化,不同的是,pH值越低,酶活下降越多,而pH值越高,酶活則比較穩(wěn)定,但總體上看pH值為3.5時漆酶表現(xiàn)出最高的吸光度值。

      圖2 pH值對漆酶穩(wěn)定性的影響

      3.2 給酶量對漆酶固定化的影響

      用pH值為3.5的磷酸緩沖液配制不同濃度的漆酶溶液,分別在SBA-15上固定20 h,測得不同給酶量(漆酶與載體的質(zhì)量比)下固定化漆酶的活性,結(jié)果如圖3所示,固定化漆酶的活性隨著給酶量的增大先升高,當(dāng)給酶量為48 mg/g時,固定化漆酶的活性最高,繼續(xù)增大給酶量,固定化漆酶的活性反而有所降低,這可能是因?yàn)樨?fù)載于SBA-15分子篩孔道內(nèi)的漆酶分子過多,影響了反應(yīng)過程中物質(zhì)的擴(kuò)散與傳輸效率。

      圖3 給酶量對固定化漆酶活性的影響

      3.3 固定化漆酶的操作穩(wěn)定性

      與游離漆酶相比,固定化漆酶可以重復(fù)利用,經(jīng)過反復(fù)8批次的反應(yīng),結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看到,第1批次反應(yīng)后,固定化漆酶的活性有所下降,可能是一些與載體結(jié)合較弱的漆酶在反應(yīng)中被洗脫,第5批次反應(yīng)后,固定化漆酶的活性又有所下降,可能是操作過程中固體反復(fù)使用有所損失造成的。盡管如此,經(jīng)過8批次的反應(yīng)后,固定化漆酶的剩余活性仍然達(dá)到85%以上,表現(xiàn)出較好的操作穩(wěn)定性,具有一定的應(yīng)用價值。

      圖4 固定化漆酶的操作穩(wěn)定性

      4 結(jié)論

      SBA-15介孔分子篩是一種具有大比表面積和豐富孔道結(jié)構(gòu)的無機(jī)材料,機(jī)械強(qiáng)度高,水熱穩(wěn)定性好,是進(jìn)行酶固定化的優(yōu)異載體。本研究結(jié)果表明,通過物理吸附法,漆酶可以固定于SBA-15的孔道內(nèi),在pH值為3.5,給酶量為48 mg/g時,可以得到性能較佳的固定化漆酶。與游離漆酶相比,固定化漆酶經(jīng)過8批次的反應(yīng)后,剩余活性仍然達(dá)到85%以上,表現(xiàn)出良好的操作穩(wěn)定性,具有一定的應(yīng)用價值。

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