杜旭升，李東繁

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬西安市中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科(西安710003)

近年來(lái)，汽車尾氣、煤炭燃燒、建筑揚(yáng)塵等產(chǎn)生的大量顆粒物，使大氣污染愈發(fā)嚴(yán)重，由此形成的霧霾天氣對(duì)人類日常活動(dòng)和生命健康產(chǎn)生嚴(yán)重影響。在空氣污染物中，細(xì)顆粒物(PM2.5)顆粒細(xì)小，傳播遠(yuǎn)，表面有致病菌、重金屬、多環(huán)芳烴等多種有毒有害物質(zhì)，且可直接作用于下呼吸道，對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病的影響最為明顯[1]。自噬對(duì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持具有重要意義，為機(jī)體主要的溶酶體降解途徑，研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5等的外界刺激可引起活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平增加，使機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而促使自噬的增強(qiáng)[2]。核因子相關(guān)因子2(Nuclear factor related factor 2，Nrf2)屬于抗氧化調(diào)節(jié)因子，能夠通過(guò)介導(dǎo)抗氧化因子的表達(dá)，達(dá)到減輕機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的效果。核因子κB(NF-κB)為真核細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)錄因子，機(jī)體中主要以p50/p65異二聚體形式存在，能夠與多種細(xì)胞基因位點(diǎn)進(jìn)行特異性結(jié)合， NF-κB與機(jī)體腫瘤壞死因子-α、白介素-6等炎癥因子的相關(guān)性已被多項(xiàng)研究證實(shí)[3]。目前關(guān)于PM2.5對(duì)肺部自噬及Nrf2、NF-κB表達(dá)的影響機(jī)制尚未完全明確，因此，本研究通過(guò)建立不同濃度的PM2.5小鼠模型，對(duì)此進(jìn)行了相關(guān)研究。

材料與方法

1 材 料 TEMED購(gòu)自Amresco公司，磷酸酶抑制劑、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA裂解液和PMSF購(gòu)自碧云天公司，兔抗P65、兔抗Nfr2購(gòu)自武漢三鷹公司，胞漿胞核蛋白提取試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司，兔抗LC3B 購(gòu)自Cell signaling公司，HRP標(biāo)記羊抗兔二抗、HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。選取SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠32只，體質(zhì)量18～20 g，隨機(jī)分為正常組、低劑量組、中劑量組和高劑量組、每組8只。

2 實(shí)驗(yàn)方法 ①PM2.5制備： 于2016年11月15日起，將西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)樓頂作為PM2.5采集點(diǎn)，使用PM2.5中流量大氣顆粒物采樣器進(jìn)行PM2.5的收集，連續(xù)收集兩周。將采樣濾膜剪碎后，置于甲醇中，并進(jìn)行超聲、洗脫、過(guò)濾、烘干等操作后，置于冰箱中保存?zhèn)溆?。②PM2.5動(dòng)物模型的制作： 使用具有通風(fēng)口的4 L有機(jī)玻璃容器，正常組使用生理鹽水，低劑量組、中劑量組和高劑量組使用PM2.5，濃度分別為25 mg/L、50 mg/L和100 mg/L，通過(guò)霧化進(jìn)入容器中，每次將不同組別小鼠置于容器中熏繞30 min，3次/d，連續(xù)進(jìn)行4周。于末次熏繞1 h后，將小鼠通過(guò)眼球放血進(jìn)行處死，隨后將肺臟取出，置于4%甲醛溶液中保存?zhèn)溆谩?/p>

3 觀察指標(biāo) ①不同濃度PM2.5對(duì)小鼠肺組織的影響： 將不同組別小鼠肺組織石蠟包埋后，進(jìn)行切片、熒光染色后，置于顯微鏡下觀察。②肺部自噬相關(guān)蛋白：LC3Ⅱ、 LC3Ⅰ表達(dá)的檢測(cè) 對(duì)四組小鼠使用Western blotting法進(jìn)行肺部自噬蛋白LC3Ⅱ、 LC3Ⅰ表達(dá)的檢測(cè)，取小鼠肺部組織，勻漿后對(duì)肺部蛋白進(jìn)行提取，使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定，蛋白質(zhì)電泳分離蛋白后，分別將一抗Beclin1、LC3加入，封閉過(guò)夜后，加入二抗，掃膜后對(duì)LC3的光密度值進(jìn)行計(jì)算，并使用LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ表示肺部自噬結(jié)果。③不同濃度PM2.5對(duì)小鼠Nrf2、NF-κB表達(dá)的影響：四組小鼠使用Western blotting法進(jìn)行肺部組織中Nrf2、NF-κB p65蛋白表達(dá)的檢測(cè)，取小鼠肺部組織，勻漿后對(duì)肺部蛋白進(jìn)行提取，使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定，蛋白質(zhì)電泳分離蛋白后，分別將兔抗Nfr2、兔抗P65、二抗加入，掃膜后對(duì)Nfr2、P65的光密度值進(jìn)行計(jì)算，并使用Nfr2/LaminB、P65/LaminB的光密度值表示檢測(cè)結(jié)果。④激光共聚焦顯微鏡下肺部細(xì)胞自噬的觀察： 將人支氣管上皮樣細(xì)胞(Beas-2B)細(xì)胞接種至24孔板，使細(xì)胞覆蓋至50%，培養(yǎng)后，分為兩組，其中對(duì)照組僅轉(zhuǎn)染pEGFP-LC3質(zhì)粒，pEGFP-LC3質(zhì)粒+PM2.5組在轉(zhuǎn)染pEGFP-LC3質(zhì)粒后，將細(xì)胞置于PM2.5濃度為100 mg/L的環(huán)境中暴露48 h，使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞自噬情況進(jìn)行觀察。

結(jié) 果

1 不同濃度PM2.5對(duì)小鼠肺組織的影響 正常組小鼠肺組織未見(jiàn)炎性改變，肺泡分布均勻、連接緊密，泡腔內(nèi)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，小支氣管黏膜、支氣管壁結(jié)構(gòu)完整，肺部毛細(xì)血管未見(jiàn)出血。低劑量組小鼠肺組織發(fā)生部分炎性改變，肺泡結(jié)構(gòu)較為完整，相比正常組明顯偏大，肺泡中可見(jiàn)少量炎性改變，同時(shí)可見(jiàn)支氣管黏膜損傷，并伴有少量出血。中劑量組小鼠肺組織炎性改變進(jìn)一步加重，肺泡中可見(jiàn)大量炎性改變，肺泡間隙明顯增加，并發(fā)生斷裂、融合。高劑量組小鼠肺組織中可見(jiàn)肺泡、肺泡間隙、支氣管被大量炎性細(xì)胞充滿，肺泡同時(shí)可見(jiàn)嚴(yán)重?cái)嗔?。?jiàn)圖1。

注：A：正常組HE染色；B：低劑量組HE染色；C：中劑量組HE染色；D：高劑量組HE染色

圖1 不同濃度PM2.5對(duì)小鼠肺組織的影響(×100)

2 不同濃度PM2.5對(duì)小鼠肺部自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)的影響 不同組別間，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ條帶分吸光度比值明顯不同(P<0.05)。與正常組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ條帶分吸光度比值明顯較高(P<0.05)，且呈現(xiàn)明顯的濃度效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表1。

圖2 不同濃度PM2.5對(duì)小鼠肺部自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)的影響

表1不同濃度PM2.5對(duì)小鼠肺部自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)的影響

注：與正常組相比，*P<0.05；與低劑量組相比，#P<0.05；與中劑量組相比，△P<0.05

3 不同濃度PM2.5對(duì)小鼠肺部Nrf2、NF-κB表達(dá)的影響 正常組Nfr2/LaminB、NF-κB p65/LaminB的光密度值明顯低于低劑量組、中劑量組和高劑量組，PM2.5暴露可導(dǎo)致小鼠肺部細(xì)胞內(nèi)Nfr2/LaminB、NF-κB p65/LaminB的光密度值明顯增加(P<0.05)，且具有明顯的濃度效應(yīng)(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表2。

4 激光共聚焦顯微鏡下肺部細(xì)胞自噬的觀察 對(duì)于僅轉(zhuǎn)染pEGFP-LC3質(zhì)粒的細(xì)胞，LC3在胞漿中均一表達(dá)，部分細(xì)胞細(xì)胞核中見(jiàn)少量LC3蛋白聚集，熒光強(qiáng)度較弱。對(duì)于轉(zhuǎn)染的pEGFP-LC3質(zhì)粒和PM2.5的細(xì)胞，LC3在細(xì)胞漿中呈現(xiàn)聚集性表達(dá)，細(xì)胞核內(nèi)現(xiàn)少量明亮的熒光斑點(diǎn)，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。見(jiàn)圖4。

圖3 不同濃度PM2.5對(duì)小鼠肺部Nrf2、NF-κB表達(dá)的影響

表2不同濃度PM2.5對(duì)小鼠肺部Nrf2、NF-κB表達(dá)的影響

注：與正常組相比，*P<0.05；與低劑量組相比，#P<0.05；與中劑量組相比，△P<0.05

討 論

PM2.5組成復(fù)雜，其內(nèi)所含的多種毒害物質(zhì)可伴隨呼吸運(yùn)動(dòng)下沉至肺部，隨后經(jīng)由循環(huán)系統(tǒng)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、心臟等多個(gè)器官、系統(tǒng)產(chǎn)生危害，其中對(duì)于呼吸系統(tǒng)的影響最為直接[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論P(yáng)M2.5暴露時(shí)間為長(zhǎng)期或者短期，均可對(duì)哮喘、慢阻肺、肺癌等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生一定影響[5]。目前多認(rèn)為PM2.5對(duì)機(jī)體呼吸系統(tǒng)的影響主要通過(guò)氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)進(jìn)行[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5進(jìn)入機(jī)體后，可導(dǎo)致氧化-抗氧化平衡被打破，使ROS自由基在體內(nèi)發(fā)生滯留，鈣離子濃度增加，進(jìn)而引起肺組織的氧化應(yīng)激損傷[7]。也有研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5能夠成濃度依賴性的激活促炎因子基因的表達(dá)，并可使機(jī)體對(duì)病原菌的清除能力降低，進(jìn)而使炎癥因子水平提升，增加肺部感染發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[8]。此外，PM2.5還可使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，促使鈣離子信號(hào)通路激活，刺激炎癥因子的釋放[9]。本研究對(duì)不同濃度PM2.5對(duì)小鼠肺組織的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，PM2.5對(duì)小鼠肺組織的影響呈現(xiàn)濃度依賴性，隨著PM2.5濃度的增加，小鼠肺組織中的肺泡結(jié)構(gòu)受損明顯增強(qiáng)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)更為明顯。

圖4 激光共聚焦顯微鏡下肺部細(xì)胞自噬的觀察

自噬為機(jī)體細(xì)胞的程序性死亡，是面對(duì)內(nèi)外刺激時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生的非損傷性應(yīng)答。當(dāng)發(fā)生自噬時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中處于游離狀態(tài)的LC3Ⅰ逐漸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3Ⅱ，因此LC3Ⅱ/LC3Ⅰ可以用來(lái)表示細(xì)胞自噬程度。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著PM2.5濃度的增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明顯增加，表明PM2.5能夠促進(jìn)肺部細(xì)胞自噬的發(fā)生，且肺部細(xì)胞自噬程度呈現(xiàn)PM2.5濃度依賴性。本研究隨后于激光共聚焦顯微鏡下對(duì)Beas-2B的自噬進(jìn)行觀察，結(jié)果證實(shí)PM2.5能夠促進(jìn)肺部細(xì)胞自噬的發(fā)生。有研究認(rèn)為，PM2.5對(duì)小鼠肺部自噬的影響可能是通過(guò)對(duì)肺泡上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)產(chǎn)生[10]。也有學(xué)者對(duì)PM2.5對(duì)肺癌細(xì)胞自噬的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，PM2.5可引起肺癌細(xì)胞的自噬，通過(guò)對(duì)自噬的阻礙有利于促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡[11]。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于腦缺血大鼠模型，適度自噬有助于對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)，當(dāng)自噬過(guò)度發(fā)生則會(huì)對(duì)大鼠神經(jīng)功能產(chǎn)生影響，而通過(guò)對(duì)自噬抑制能夠有效降低腦缺血損傷[12]。關(guān)于自噬程度對(duì)肺部疾病的影響還需進(jìn)行更為深入的研究。

Nrf2為調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要因子，其能夠通過(guò)與ARE作用，達(dá)到對(duì)抗氧化蛋白的調(diào)控作用，進(jìn)而起到降低外來(lái)刺激、機(jī)體炎癥反應(yīng)以及保護(hù)機(jī)體功能的效果[13]。研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5能夠刺激肺部組織Nrf2的表達(dá)，促進(jìn)卵泡抑素的釋放，使NADPH氧化酶-1分泌減少，進(jìn)而使機(jī)體抗氧化能力提升[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5對(duì)小鼠肺組織Nrf2的影響呈濃度依賴性，隨著PM2.5濃度的增加，Nrf2表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示PM2.5能夠引起機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)肺部組織產(chǎn)生損傷。NF-κB在調(diào)節(jié)炎癥因子釋放的過(guò)程中具有多向性，PM2.5可引起肺泡上皮細(xì)胞釋放多種炎癥因子，研究發(fā)現(xiàn)，這些因子的釋放可能與NF-κB信號(hào)通路的激活有關(guān)，PM2.5可致機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，刺激了NF-κB的表達(dá)，進(jìn)而使炎癥反應(yīng)增加[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB的表達(dá)與PM2.5濃度變化呈現(xiàn)濃度依賴性，隨著PM2.5濃度的增加，小鼠肺部組織中NF-κB p65的水平明顯增加，進(jìn)一步驗(yàn)證了PM2.5與肺部炎性改變的相關(guān)性。

綜上所述，PM2.5能夠使小鼠肺部組織發(fā)生炎性改變，且呈濃度依賴性的提高小鼠肺部自噬、Nrf2以及NF-κB水平，提示PM2.5通過(guò)使機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肺部組織損傷，然而關(guān)于PM2.5對(duì)肺部病變的影響機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。