楊斌，邵雪君，朱宏

（蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 蘇州 215000）

淋巴細(xì)胞是機(jī)體適應(yīng)性免疫功能的主要承擔(dān)者，其各亞群間的相互協(xié)調(diào)、相互制約，進(jìn)而形成穩(wěn)定的免疫應(yīng)答反應(yīng)。外周血中成熟的T淋巴細(xì)胞主要包括表達(dá)CD4+輔助性T細(xì)胞及表達(dá)CD8+抑制性T細(xì)胞兩個(gè)亞群，并且兩者處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡及相互調(diào)節(jié)狀態(tài)；而B(niǎo)淋巴細(xì)胞則是體液免疫的主要參與者，產(chǎn)生的免疫球蛋白是抵抗病毒及細(xì)菌等病原微生物的直接作用機(jī)制；另外，NK細(xì)胞是機(jī)體固有免疫反應(yīng)的主要參與者。本研究的目的主要是對(duì)HRV感染所致毛細(xì)支氣管炎患兒的外周血淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測(cè)，并將HRV與RSV感染毛細(xì)支氣管炎患兒及正常健康兒童的外周血中淋巴細(xì)胞亞群的比例變化進(jìn)行性對(duì)比分析，以便更好的認(rèn)識(shí)不同HRV感染的毛細(xì)支氣管炎患兒的免疫應(yīng)答狀態(tài)，為臨床診斷和治療兒童HRV感染毛細(xì)支氣管炎提供客觀的理論依據(jù)。

1 方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2016年1月-2019年7月在蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院呼吸科住院的2歲以下毛細(xì)支氣管炎患兒32例，其中HRV陽(yáng)性9例，RSV陽(yáng)性的患兒23例，所有患兒經(jīng)呼吸道病毒檢測(cè)時(shí)，都僅發(fā)現(xiàn)一種病毒感染，而且均表現(xiàn)為第一次喘息，其診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》第7版[19]，并排除其他喘息性疾病、先天性心臟病、免疫功能缺陷、先天性氣道發(fā)育畸形、神經(jīng)肌肉疾病及遺傳性疾病等。隨機(jī)選取同期2歲以下門(mén)診體檢健康兒童24例，其中男14例，女10例。分組：按照病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果分為HRV感染組、RSV感染組及正常對(duì)照組。

1.2 試劑和儀器 CD3-FITC/CD8-APC-Cy7/CD45PerCPCy5.5/CD4-PC7/CD16+ CD56- PE 熒光單克隆抗體試劑盒（北京同生時(shí)代生物技術(shù)有限公司）；流式細(xì)胞儀用紅細(xì)胞裂解液（BD，美國(guó)）；量程范圍適用于20、100 μL、1 mL的移液器及一次性吸頭；渦旋振蕩器； 低速離心機(jī)； 流式細(xì)胞分析（FACS canto II，BD，美國(guó)）。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 標(biāo)本采集 入院后當(dāng)天采集外周靜脈血2 mL，肝素鈉抗凝送檢。

1.3.2 淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定 使用流式細(xì)胞儀（FACS canto II，BD，美國(guó)）檢測(cè)標(biāo)本，操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)：（1）在流式管底部加入20 μL CD3-FITC/CD8-APC-Cy7/CD45PerCP-Cy5.5/CD4-PC7/CD16+CD56-PE/試劑于試管底部；（2）采用反向移液吸取50 μL混勻的肝素抗凝血，加入管底，避免血液碰到管壁。（3）輕輕渦動(dòng)混勻約3 s，室溫避光孵育15-25 min。（4）向管內(nèi)加入450 μL 1×流式細(xì)胞儀用溶血?jiǎng)?。?）輕輕渦動(dòng)混勻10 s，室溫避光孵育15 min。（6）上機(jī)檢測(cè)，淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果由BD Canto軟件自動(dòng)獲取，測(cè)定CD3+、CD3+/CD4+、CD3+/CD8+、CD19+、CD16+CD56+細(xì)胞相對(duì)計(jì)數(shù)及CD4+/CD8+。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以（Mean±SD）表示；采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

三組間淋巴細(xì)胞亞群比例的差異比較，如表1所示：HRV感染組、RSV感染組及正常對(duì)照組之間CD3+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞及CD4+/CD8+比值存在明顯差異，F(xiàn)值分別為：4.452，25.151，19.004，P值均＜0.05。其中，HRV感染的毛細(xì)支氣管炎患兒的CD3+T細(xì)胞在三組比較中表達(dá)最低，而RSV感染者CD3+CD8+T細(xì)胞比例及CD4+/CD8+比值均高于HRV感染患兒。CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3-CD19+B細(xì)胞和CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞比例的差異則無(wú)明顯差異，F(xiàn)值分別為：2.598，2.467，1.109（P值均＞0.05）。

表1 HRV和RSV感染的毛細(xì)支氣管炎患兒及正常對(duì)照組三者間淋巴細(xì)胞亞群比例比較（Mean±SD）

3 討論

病毒是引起兒童毛細(xì)支氣管炎的主要病原之一，其病理改變主要包括炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；粘膜充血、水腫，可伴有上皮細(xì)胞壞死脫落；粘液分泌增加和平滑肌痙攣等[1]。臨床上常表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、喘憋，這些癥狀較難與肺炎的癥狀相區(qū)別，為此有人稱(chēng)之為喘憋性肺炎。病毒性毛細(xì)支氣管炎多見(jiàn)于2歲以下兒童，相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查研究顯示[2.3]，0-1歲嬰幼兒的發(fā)病率約18%-32%，1-2歲幼兒的發(fā)病率為9%-17%，現(xiàn)已成為臨床一個(gè)巨大負(fù)擔(dān)。引起毛細(xì)支氣管炎的病毒譜較為廣泛，包括呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）、HRV、人博卡病毒（human bocavirus，HBoV）、人偏肺病毒（human metapneumovirus,HMPV）、副流感病毒（parainfluenza virus，Pinf）、腺病毒（adenovirus，ADV）和流感病毒（influenzavirus，Inf）等，其中RSV和HRV是兒童毛細(xì)支氣管炎最主要的兩種病原體[4]。相關(guān)研究顯示[5]，1歲以?xún)?nèi)毛細(xì)支氣管炎患兒以RSV感染為主，1歲以上患兒HRV感染上升為最主要地位。

兒童呼吸道系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，并且自身的免疫系統(tǒng)也在不斷完善之中，所以較為容易被呼吸道病毒入侵，引起呼吸道感染。檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群有助于了解機(jī)體免疫狀況及一些疾病的監(jiān)測(cè)。最常檢測(cè)的亞群包括T細(xì)胞（CD3+）、B細(xì)胞（CD19+）、NK細(xì)胞（CD16+CD56+）、輔助性T細(xì)胞（CD4+）和抑制性T細(xì)胞（CD8+）等。

本次研究發(fā)現(xiàn)，HRV感染的毛細(xì)支氣管炎患兒相較正常健康兒童，外周淋巴細(xì)胞亞群變化主要表現(xiàn)為CD3+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞比例明顯下降，CD3-CD19+B細(xì)胞比例和CD4+/CD8+比值則明顯上升， 為此，HRV感染毛細(xì)支氣管炎患兒的淋巴細(xì)胞亞群存在明顯的比例失衡，進(jìn)而表現(xiàn)出不同程度的免疫功能紊亂。