丁 聰，陳 俊，潘 敦，何亞駿，鄧燕萍，柳賢福

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院，中國 南寧 530222)

紫金牛科植物心葉紫金牛Ardisiamaclurei的全株，為瑤藥傳統(tǒng)老班藥(經(jīng)典瑤藥)“七十二風(fēng)”中的一種——走馬風(fēng)[1]，瑤藥稱之為yangh maz buerng(養(yǎng)馬崩)，別名小馬胎、紅云草、紅鋪地毯、鋪地走馬。微苦、澀、平，屬“風(fēng)藥”，生長于海拔230～860 m 的密林下或水旁、石縫間陰濕處，分布于廣西、海南、貴州、廣東、臺灣等省區(qū)[2]。廣西主產(chǎn)區(qū)為蒙山、昭平、金秀、藤縣、平果、龍勝、恭城、都安、羅城、武宣、興安等縣市[3，4]。走馬風(fēng)具有調(diào)經(jīng)通絡(luò)、活血止血、消腫止痛及鎮(zhèn)咳祛痰的作用，瑤醫(yī)多用于婦女月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、產(chǎn)后惡露不盡、產(chǎn)后體虛等多種婦科常見病的治療[5-9]。該藥的活性成分主要有皂苷類、苯醌類、苯酚類、香豆素類、黃酮類、三萜類等[10，11]。本文采用HPLC法對心葉紫金牛中巖白菜素和漢黃芩素[12，13]的含量進(jìn)行同時測定，為瑤藥心葉紫金牛質(zhì)量評價提供參考依據(jù)，有助于研究和開發(fā)廣西民間藥用資源。

1 儀器與試藥

Agilent1200高效液相色譜法( 安捷倫科技有限公司)，AL204梅特勒萬分之一電子天平(梅特勒托利多)，JWS-12恒溫水浴鍋(上海錦玟儀器設(shè)備有限公司)。巖白菜素(批號5759，純度≥98.0%，檢測方法：HPLC)、漢黃芩素(批號5325，純度≥98.0%，檢測方法：HPLC)購于上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司。甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水(Millipore Simplicity-185超純水儀，美國密里博公司)，其余試劑為分析純。6批藥材中有3批購自制藥公司(見表1)，另外3批于2019年3月自行采收：S4采自廣西南寧，S5采自廣西百色，S6采自廣西河池。經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院生藥教研室苑敏副教授鑒定均為紫金?？浦参镄娜~紫金牛Ardisiamaclurei的干燥根。

表1 心葉紫金牛藥材信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Syncronis C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；檢測波長為274 nm；流動相為甲醇(B)-0.2%磷酸(A)系統(tǒng)，梯度洗脫(0～10 min，30%B；10～20 min, 30%→80%B；20～30 min，80%B)；流速為1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

精密稱取105 ℃干燥至恒重的巖白菜素、漢黃芩素對照品適量，加甲醇制成含巖白菜素0.272 g·L-1、漢黃芩素0.148 g·L-1的混合對照品溶液。取心葉紫金牛藥材粉末(過0.425 mm篩)約1 g，精密稱定，精密加入甲醇溶液20 mL，稱取質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷，用甲醇溶液補(bǔ)足減少的質(zhì)量，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，備用。

2.3 專屬性試驗

分別精密吸取“2.2”項下對照品混合溶液和供試品(S1)溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1。

圖1心葉紫金牛樣品(A)和混合對照品圖譜(B)

Fig.1Sample chromatogram(A) and mixed reference substance chromatogram(B)

2.4 供試品處理的正交試驗

根據(jù)對樣品的單因素考察結(jié)果以及巖白菜素和漢黃芩素的性質(zhì)，選定以甲醇為提取溶劑進(jìn)行超聲提取。采用正交試驗L9(34)，選擇甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、甲醇用量(B)、提取時間(C)3個因素，每個因素設(shè)3個水平[14]，對心葉紫金牛藥材進(jìn)行提取工藝研究，以巖白菜素和漢黃芩素的含量為評價指標(biāo)，正交設(shè)計表及分析結(jié)果見表2～4。

表2 正交設(shè)計因素水平表

表3 白菜素和漢黃芩素L9(34)正交試驗直觀分析表

表4 白菜素和漢黃芩素方差分析表

因素極差R越大，說明因素的水平改變對實驗結(jié)果影響也越大。根據(jù)表3可知，各實驗因素對巖白菜素和漢黃芩素提取效果的影響順序為A>B>C。由表4可知因素A(甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù))P<0.05，因素A具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對試驗結(jié)果有顯著性影響，綜合直觀分析和方差分析的結(jié)果，考慮到實際生產(chǎn)成本等問題，確定最佳提取方法為A3B1C1，即用20 mL 100%甲醇溶液超聲提取30 min。

為驗證優(yōu)選工藝A3B1C1的可靠性和合理性，進(jìn)行驗證試驗：取3份S1粉末，按“2.1”項下所述方法進(jìn)行測定，結(jié)果巖白菜素平均含量5.032 4 mg·g-1，RSD值=1.06%，漢黃芩素0.505 7 mg·g-1，RSD值=1.69%。表明本實驗優(yōu)化的工藝具有一定的穩(wěn)定性，說明優(yōu)化成功。

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取2.2項下對照品混合溶液1，4，8，12及16 μL，按2.1項下的色譜條件用高效液相色譜儀測定峰面積(見表5)。以對照品溶液進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，其色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，見圖2，得出巖白菜素回歸方程為y= 1 713.1x- 77.373，R2= 0.999 1；漢黃芩素回歸方程為y= 1 293.1x+ 4.342，R2= 0.999 5。結(jié)果表明巖白菜素和漢黃芩素在進(jìn)樣量分別為0.272～4.352 μg和0.148～2.368 μg時呈良好的線性關(guān)系。

表5 線性關(guān)系考察結(jié)果

圖2標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖(A巖白菜素，B漢黃芩素)

Fig.2Standard working curve(Bergenin(A)， Wogonin(B))

2.6 精密度試驗

精密吸取S1供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，按2.1項下的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定樣品中巖白菜素和漢黃芩素的峰面積，其RSD值為0.80%和1.36%(見表6)，表明所用高效液相色譜儀的精密度好。

表6精密度試驗結(jié)果

Tab.6Precision test results

成分峰面積123456RSD值/%巖白菜素4 196.54 190.34 148.14 220.74 130.34 170.30.80漢黃芩素374.3373.7370.7369.3365.4380.21.36

2.7 重復(fù)性試驗

取S1心葉紫金牛藥材粉末6份，每份1 g，精密稱定，按2.2項下供試品制備方法制備，按2.1項下的色譜條件，精密吸取供試品溶液10 μL進(jìn)行分析，計算巖白菜素和漢黃芩素的含量，其RSD值為1.12%和1.52%(見表7)。結(jié)果表明，用上述方法測定巖白菜素和漢黃芩素的含量，重復(fù)性好。

表7 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性試驗

取S1心葉紫金牛藥材粗粉約1 g，精密稱定，按2.2項下方法制備溶液，室溫下保存，分別在0，2，6，10，16及24 h精密吸取樣品溶液10 μL注入液相色譜儀，按2.1項下的色譜條件測定，考察其穩(wěn)定性。結(jié)果測得樣品中巖白菜素和漢黃芩素峰面積RSD值為0.97%和1.38%(見表8)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

表8 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量S1心葉紫金牛藥材粉末約0.5 g，精密稱定，精密加入20 mL甲醇溶液，分別精密加入一定量的2個成分對照品(加入量分別為樣品含量的80%，100%和120%)。按2.2項下方法制備，各平行制備3份，按2.1項下色譜條件分別測定含量，結(jié)果見表9。實驗結(jié)果可知，巖白菜素和漢黃芩素的平均加樣回收率為99.40% 和98.91% (RSD值為1.30%和1.28%)。

表9加樣回收試驗結(jié)果(n=9)

Tab.9Sample recovery test results(n=9)

化合物樣品量/g已知量/mg加入量/mg測得量/mg加樣回收率/%平均加樣回收率/%RSD值/%巖白菜素0.501 62.526 62.024.533 599.350.502 52.531 12.024.523 698.640.502 72.532 12.024.499 297.380.502 22.529 62.525.025 599.040.503 22.534 62.525.045 999.650.506 22.549 72.525.032 198.510.502 92.533 13.065.579 299.550.507 22.554 83.065.634 2100.640.506 62.551 73.065.668 9101.8799.401.30漢黃芩素0.501 60.253 40.205 00.457 599.560.502 50.253 9 0.205 00.453 897.530.502 70.254 00.205 00.459 1100.070.502 20.253 70.253 00.504 499.090.503 20.254 20.253 00.510 1101.140.506 20.255 70.253 00.504 198.170.502 90.254 10.316 00.568 299.410.507 20.256 2 0.316 00.564 397.490.506 60.255 90.316 00.564 897.7498.911.28

2.10 樣品測定

分別取廣西不同產(chǎn)地心葉紫金牛藥材粉末(每個產(chǎn)地各3份)約1 g，精密稱定，按2.2項下方法制備樣品，按2.1項下色譜條件，精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀測定，實驗結(jié)果見表10。

表10 不同產(chǎn)地心葉紫金牛藥材含量測定結(jié)果(n=3) 單位：mg·g-1

3 結(jié)論與討論

(1)通過預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)，超聲提取法和加熱回流提取法測得巖白菜素和漢黃芩素的含量相近，考慮到回流提取操作較超聲提取繁瑣，故選擇超聲提取法。對比乙醇溶液和甲醇溶液提取效果，結(jié)果顯示乙醇提取液圖譜峰型較差，因此選擇提取效果好的甲醇作為提取溶劑。通過DAD檢測器3D圖譜掃描[15-17]，發(fā)現(xiàn)在274 nm波長處巖白菜素和漢黃芩素吸收最佳，故選擇274 nm作為測定波長。

(2)心葉紫金牛的化學(xué)成分研究表明其含有巖白菜素和漢黃芩素，但尚未有這兩種化合物提取工藝及同時測定兩種含量的相關(guān)報道。巖白菜素和漢黃芩素是該藥材的主要活性成分，故選擇其作為測定指標(biāo)[9,10]。本實驗發(fā)現(xiàn)，心葉紫金牛藥材中巖白菜素含量較高，漢黃芩素含量相對較低。不同產(chǎn)地間成分差異較大，本研究結(jié)果可為今后心葉紫金牛藥材的開發(fā)利用和質(zhì)量控制提供一定的參考依據(jù)。