宋旸，劉影

(齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾，161006)

大豆分離蛋白(soybean protein isolate，SPI)是許多食品配方中的重要成分，其氨基酸組成和比例平衡且合理，可以與動物蛋白相媲美，能夠替代和拓展動物蛋白在食品體系中的功能作用[1]。為了滿足工業(yè)上對專用功能型大豆分離蛋白的需求，常采用改性的手段來顯著改善大豆分離蛋白的某一功能特性。糖基化改性是通過美拉德反應(yīng)與糖進行接枝改性,這種改性方式不需要催化劑，安全可靠。KATO等[2]在1988年研究表明了乳清蛋白的功能性質(zhì)可以通過與葡聚糖的糖基化反應(yīng)得到改善，從此利用蛋白質(zhì)的糖基化改性提高功能性特性逐漸成為人們研究的熱點[3-12]。

葫蘆巴是一種生長在北非，地中海，西亞，北印度并且現(xiàn)在在加拿大也培育的豆科植物。葫蘆巴膠(fenugreek gum，F(xiàn)G)是一種半乳甘露聚糖，具有很好的表面活性，可以作為一種有效的水包油乳化液的穩(wěn)定劑[13]。在11種商業(yè)用膠和5種實驗室制備膠中葫蘆巴膠在水包油乳狀液模型系統(tǒng)中表現(xiàn)出最好的穩(wěn)定性[14]。KASRAN等[15]研究了大豆乳清分離蛋白與葫蘆巴膠在干熱的條件下進行美拉德共價交聯(lián)反應(yīng)，使乳化特性得到提高。但采用干法進行糖基化改性普遍存在耗時長、能耗大、不適合工業(yè)生產(chǎn)等缺點。本文利用微波輔助大豆分離蛋白與葫蘆巴膠的糖基化反應(yīng)，通過微波作用使大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)變得更加松散，使內(nèi)部包埋的基團暴露，加快糖基化反應(yīng)的進程，大大縮短了糖基化反應(yīng)的時間。該文研究了不同的微波時間、大豆分離蛋白與葫蘆巴膠的質(zhì)量比、糖基化反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度對大豆分離蛋白乳化性的影響，通過響應(yīng)面法優(yōu)化出最佳改性條件，考察了結(jié)合物乳化性的變化，使大豆分離蛋白能夠更好地應(yīng)用在工業(yè)生產(chǎn)之中。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白，河南萬邦實業(yè)有限公司；葫蘆巴膠，中凱食品配制有限公司；十二烷基磺酸鈉，天津市科密歐化學試劑有限公司；大豆油，九三集團非轉(zhuǎn)基因大豆油；Na2HPO4和Na2HPO4，長春化學試劑廠；KBr，天津市博迪化工有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

海爾微波爐(MK-2485MG)，青島海爾微波制品有限公司；高速分散機(T18)，德國IKA公司；紫外可見分光光度計(UV-5100)，上海元析儀器有限公司；冷凍干燥機(FD5)，美國SIM公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 微波輔助糖基化SPI的乳化液制備

將SPI與FG以一定的質(zhì)量比均勻混合后，用水溶解調(diào)至6%，利用功率為850 W的微波爐進行輻射加熱，為了防止升溫過快, 采用間歇式加熱, 即微波輻射3 min，冰浴3 min，使溫度降下來并停止反應(yīng)，再進行微波輻射[16]；微波處理一定時間后于-20 ℃保存再冷凍干燥。將干燥后的粉狀物放置在底部含有飽和NaCl溶液的干燥器內(nèi)進行反應(yīng),保持溫度60 ℃,相對濕度75%[15]。

1.3.2 大豆分離蛋白乳化性的測定[17]

用0.2 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液配制1 mg/mL大豆分離蛋白溶液，取30 mL樣品，加入10 mL大豆油以轉(zhuǎn)速為10 000 r/min在室溫下均質(zhì)1 min形成均勻的乳化液然后靜置。分別在靜置后的第0 min和第10 min從乳化液底部吸取100 μL，用5 mL 0.1%的十二烷基磺酸鈉(SDS)稀釋，在500 nm條件下測定吸光值。乳化活性(EA)用0 min的樣品吸光值A(chǔ)0表示，乳化穩(wěn)定性(ES)用乳化穩(wěn)定指數(shù)(ESI)表示為A0×Δt/ΔA,其中Δt為時間差10 min，ΔA為Δt內(nèi)的吸光值之差。

1.3.3 糖基化程度的測定

參考LERTITTIKULA等[18]的方法測定糖基化程度。將125 μL改性SPI溶液加入pH 8.2的2 mL 0.21 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液中，與1 mL 0.01%的2,4,6-三硝基苯磺酸溶液混勻并充分振蕩，置于50 ℃水浴中避光反應(yīng)1 h，再將2 mL 0.1 mol/L Na2SO3溶液置于反應(yīng)液中，在室溫下冷卻30 min，在420 nm處測定吸光度At。然后在上述溶液中加入125 μL未經(jīng)水浴加熱的SPI溶液作為空白對照，于420 nm處測定其吸光度A0，根據(jù)公式(1)計算糖基化程度：

(1)

式中：A0表示未經(jīng)改性SPI吸光度；At表示改性SPI吸光度。

1.3.4 改性產(chǎn)物的表征

1.3.4.1 紅外光譜分析[19]

改性前后的樣品分別準確稱取10 mg，將一定量的KBr加入其中，研磨成均勻粉末后，壓制成薄片，并用傅里葉變換紅外光譜儀測試。

1.3.4.2 紫外光譜分析[20]

用50 mmol/L、pH 7.0的Tris-HCl緩沖溶液配制樣品濃度為10 g/L，測量在不同波長下的吸光度值。

1.3.5 單因素實驗

1.3.5.1 微波時間對微波輔助糖基化SPI乳化性的影響

SPI與FG質(zhì)量比1∶3，反應(yīng)時間為30 min時，反應(yīng)溫度為60 ℃，考察微波時間為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 min時對SPI糖基化程度及乳化性的影響。

1.3.5.2 SPI與FG質(zhì)量比對微波輔助糖基化SPI乳化性的影響

SPI與FG質(zhì)量比1∶3，微波時間3 min，反應(yīng)時間為30 min時，反應(yīng)溫度為60 ℃，考察SPI與FG質(zhì)量比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5時對SPI糖基化程度及乳化性的影響。

1.3.5.3 反應(yīng)時間對微波輔助糖基化SPI乳化性的影響

SPI與FG質(zhì)量比為1∶3，微波時間3 min，反應(yīng)溫度為60 ℃，考察干燥器反應(yīng)時間為0、5、10、30、50、70、90、110 min時對SPI糖基化程度及乳化性的影響。

1.3.5.4 反應(yīng)溫度對微波輔助糖基化SPI乳化性的影響

SPI與FG質(zhì)量比1∶3，微波時間3 min，反應(yīng)時間為30 min時，使其反應(yīng)溫度分別是40、50、60、70、80 ℃時對SPI糖基化程度及乳化性的影響。

1.3.6 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝

依據(jù)上述單因素實驗的討論，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實驗設(shè)計原理[21-22], 采用響應(yīng)面法[23]在3因素3水平上對微波輔助糖基化改性SPI條件進行優(yōu)化。對試驗數(shù)據(jù)結(jié)果采用Design Expert 8.0.6軟件進行分析，因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素和水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗分析

2.1.1 微波時間對微波輔助糖基化SPI乳化性影響

由圖1、圖2可以看出，在SPI與FG質(zhì)量比1∶3、反應(yīng)時間30 min、糖基化反應(yīng)溫度60 ℃時, 隨著微波時間的延長，乳化活性、乳化穩(wěn)定性和糖基化程度都是先上升后下降的趨勢，在微波時間在3 min時均達到最高值。這是由于適當?shù)奈⒉ㄌ幚鞸PI能夠減弱蛋白分子間和分子內(nèi)的非共價作用，SPI的結(jié)構(gòu)變得松散，暴露更多的糖基化反應(yīng)位點，從而促進糖基化反應(yīng)的發(fā)生，同時引入更多含有親水羰基的糖鏈[24]。由于FG以共價鍵連接入SPI肽鏈中，增加了空間阻力，使得界面蛋白很難發(fā)生聚合，從而提高其乳化活性和乳化穩(wěn)定性。但過度的微波預(yù)處理，就會使得蛋白分子重新聚集，SPI糖基化反應(yīng)減弱，乳化活性和乳化穩(wěn)定性也隨之降低[25]。

圖1 微波時間對微波輔助糖基化SPI乳化性影響

圖2 微波時間對微波輔助糖基化SPI糖基化程度影響

2.1.2 SPI與FG質(zhì)量比對微波輔助糖基化SPI乳化性影響

由圖3、圖4可以看出，在微波3 min、反應(yīng)時間30 min、糖基化反應(yīng)溫度60 ℃時，隨著質(zhì)量比的增加，乳化活性、乳化穩(wěn)定性和糖基化程度都是先上升后下降的趨勢，在質(zhì)量比為1∶3時均達到最高值。當FG的質(zhì)量增加時，單位體積內(nèi)與SPI分子接觸的糖分子數(shù)量就會變多，糖基化反應(yīng)的速率就會變大，乳化活性和乳化穩(wěn)定性呈上升趨勢；但隨著添加的葫蘆巴膠的量繼續(xù)增加，由于不適當?shù)腟PI和FG比例導(dǎo)致加劇副反應(yīng)(焦糖化)的發(fā)生以及FG分子的空間位阻對糖基化反應(yīng)有阻礙，所以隨著FG的繼續(xù)添加，乳化活性和乳化穩(wěn)定性呈下降的趨勢[26]。

圖3 SPI與FG質(zhì)量比對微波輔助糖基化SPI乳化性影響

圖4 SPI與FG質(zhì)量比對微波輔助糖基化SPI糖基化程度影響

2.1.3 反應(yīng)時間對微波輔助糖基化SPI乳化性影響

由圖5、圖6可以看出，在SPI與FG質(zhì)量比1∶3、微波3 min、糖基化反應(yīng)溫度60 ℃時，隨著反應(yīng)時間的增大，乳化活性、乳化穩(wěn)定性都是先上升后下降，反應(yīng)時間在30 min時均達到最高值；糖基化程度呈逐漸增大的趨勢，在30 min后趨于平緩。微波輔助糖基化的反應(yīng)時間逐漸增大到30 min時，SPI和FG糖基化反應(yīng)程度逐漸加深，糖基化SPI降低了油水界面的張力，乳化能力有所提高[27]。隨著反應(yīng)時間的繼續(xù)延長，過多的葫蘆巴膠接枝到SPI，體現(xiàn)出顯著的親水性，所以糖基化SPI的乳化性開始呈下降的趨勢[28]。

圖5 反應(yīng)時間對微波輔助糖基化SPI乳化性影響

圖6 反應(yīng)時間對微波輔助糖基化SPI糖基化程度影響

2.1.4 反應(yīng)溫度對微波輔助糖基化SPI乳化性影響

由圖7、圖8可以看出，在SPI與FG質(zhì)量比1∶3、微波3 min、反應(yīng)時間30 min時，隨著糖基化反應(yīng)溫度的增加，乳化活性、乳化穩(wěn)定性和糖基化程度都是先上升后下降的趨勢，在60 ℃均達到最高值。說明溫度為60 ℃時，SPI糖基化反應(yīng)的效果較好，顯著地降低了油水界面的張力，提高了SPI的乳化性。但隨著溫度的繼續(xù)升高，大豆分離蛋白由于高溫容易發(fā)生熱變形，阻礙了糖基化反應(yīng)的進行，所以糖基化的程度降低，乳化性也呈下降的趨勢[29]。

圖7 糖基化反應(yīng)溫度對微波輔助糖基化SPI乳化性影響

圖8 糖基化反應(yīng)溫度對微波輔助糖基化SPI糖基化程度的影響

2.2 微波輔助糖基化SPI乳化穩(wěn)定性的響應(yīng)面分析

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以反應(yīng)時間(A)、微波時間(B)、反應(yīng)溫度(C)為自變量，以乳化穩(wěn)定性(ES)為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面分析實驗，實驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面所設(shè)計的方案和實驗結(jié)果

利用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計實驗方案，對實驗結(jié)果進行二次回歸方程的分析，可以得出，SPI乳化穩(wěn)定性Y的二次回歸方程，并對它用方差的方法分析(見表3)可知。乳化穩(wěn)定性Y的標準回歸方程為：

Y=372.01-7.69A+8.15B+15.60C+8.30AB-20.36AC-13.40BC-164.83A2-135.49B2-109.26C2

模型的決定系數(shù)與調(diào)整決定系數(shù)分別為0.965 0、0.9200，說明此模型與試驗之間擬合程度較高，證明用此模型優(yōu)化反應(yīng)時間、微波時間和反應(yīng)溫度對微波輔助糖基化改性SPI影響具有可行性。由反應(yīng)時間、微波時間、反應(yīng)溫度對響應(yīng)值的影響可以得出，回歸方程Y中的A2、B2、C2對微波輔助糖基化SPI的乳化穩(wěn)定性都有明顯的影響，而其他因素影響不是很明顯，表明各影響因素對于微波輔助糖基化SPI的影響不是簡單的線性關(guān)系。用中心標準化處理回歸方程，Y回歸方程一次項回歸系數(shù)的絕對值大小依次為C、B、A，因此，3個影響因素對乳化穩(wěn)定性影響順序為：反應(yīng)溫度(C)>微波時間(B)>反應(yīng)時間(A)。

表3 乳化穩(wěn)定性試驗結(jié)果的方差分析表

對模型中的反應(yīng)時間(A)、微波時間(B)、反應(yīng)溫度(C)其中的一個因素讓它在0水平不動時，由此可知，另外2個影響因素相互交叉作用對乳化穩(wěn)定性Y的子模型，并根據(jù)子模型，分別繪制出a、b、c三個三維響應(yīng)曲面圖，見圖9。

圖9說明了各因素對微波輔助糖基化SPI乳化穩(wěn)定性的影響。由圖9-a、9-b、9-c可以看出，3個因素與Y呈拋物線關(guān)系，隨著反應(yīng)時間、微波時間和反應(yīng)溫度的增加，乳化穩(wěn)定性先呈不同程度的上升趨勢，先達到最高點后，繼而隨著各影響因素值的增加，乳化穩(wěn)定性呈下降趨勢，這與單因素的實驗結(jié)果不約而同。并且由圖9-a和圖9-b可以看出，與反應(yīng)溫度和微波時間相比，反應(yīng)時間對SPI乳化活性的影響相對較小。

通過所得到的模型，可預(yù)測采用微波輔助糖基化法提高SPI乳化穩(wěn)定性的最好的工藝條件為：反應(yīng)時間41 min、微波時間3 min、反應(yīng)溫度58 ℃。在此條件下，微波輔助糖基化法SPI乳化穩(wěn)定性(OD500)在理論上可達371.156 min。

2.3 驗證實驗

根據(jù)上述結(jié)果進行近似驗證試驗，檢測真實值是否與試驗結(jié)果相一致。在最佳工藝條件下進行3次平行試驗，測得微波輔助糖基化SPI的乳化穩(wěn)定性(OD500)為370.38 min，與理論值相比，相對誤差在±1%以內(nèi)，而且重復(fù)性好，說明優(yōu)化結(jié)果是準確可靠的。

a-反應(yīng)時間和微波時間對乳化穩(wěn)定性影響的響應(yīng)面圖;b-反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度對乳化穩(wěn)定性影響的響應(yīng)面圖;c-微波時間和反應(yīng)溫度對乳化穩(wěn)定性影響的響應(yīng)面圖

2.4 未改性SPI、微波改性SPI與微波輔助糖基化SPI乳化性的對比

由圖10可以看出，在最佳的微波輔助糖基化改性條件下，將未改性的SPI、微波改性SPI和微波輔助糖基化SPI的乳化性進行對比，未改性SPI的乳化活性和乳化穩(wěn)定性數(shù)值最小，微波輔助糖基化SPI的乳化活性和乳化穩(wěn)定性數(shù)值最大，微波改性SPI的乳化活性和乳化穩(wěn)定性數(shù)值處于二者之間。由此，可知微波輔助糖基化可以顯著提高SPI的乳化性。

圖10 未改性SPI、微波改性SPI與微波輔助糖基化SPI乳化性的對比

2.5 紅外光譜分析

圖11 微波輔助糖基化改性SPI樣品的紅外光譜圖

2.6 紫外光譜分析

紫外光譜是研究蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種方法，主要體現(xiàn)在芳香族氨基酸。由圖12可知，蛋白吸收峰有所變化。微波改性的SPI吸收峰高于未改性的SPI，在270 nm附近處的吸光值也高于未改性SPI，這可能是因為微波過程中使蛋白質(zhì)疏水性生色基團露出從而使吸光值變大。微波輔助糖基化改性后的SPI在280 nm附近的吸收峰弱于未改性的SPI，并向短波方向移動，說明了SPI與FG發(fā)生了共價交聯(lián)[31]，使蛋白分子空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，導(dǎo)致酪氨酸和色氨酸對紫外線的吸收降低。

圖12 微波輔助糖基化改性SPI樣品的紫外光譜圖

3 結(jié)論

在單因素實驗基礎(chǔ)上，并通過對顯著影響因素反應(yīng)時間、微波時間和反應(yīng)溫度做響應(yīng)面分析，確定微波輔助糖基化的最佳工藝條件為反應(yīng)時間41 min、微波時間3 min、SPI與FG質(zhì)量比1∶3和反應(yīng)溫度58 ℃。其制備的微波輔助糖基化SPI的乳化穩(wěn)定性(OD500)為370.38 min，與理論值相比差異不顯著。

在最佳工藝下制備的微波輔助糖基化SPI乳化穩(wěn)定性有較大的提高,與微波改性的SPI相比，微波輔助糖基化SPI乳化活性提高了51.33%，乳化穩(wěn)定性提高了294.14%；與未改性的SPI對比，微波輔助糖基化SPI乳化活性提高了88.67%，乳化穩(wěn)定性提高了788.84%。

紅外光譜和紫外光譜分析得知，改性前后SPI的各吸收峰強度均有不同程度的變化，因此表明SPI與FG之間發(fā)生了共價交聯(lián)，改變了蛋白分子空間結(jié)構(gòu)。