盛善桂 王亞男 王少如 趙開 王云英 徐曉娜 王奇民 童磊 陳正崗

1.青島大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，青島 266003；2.青島市口腔醫(yī)院口腔頜面外科，青島 266000；3.青島市市立醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心，青島 266071；4.大連醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，大連 116044；5.青島市市立醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，青島 266000

口腔癌多為鱗狀細(xì)胞癌，其中舌鱗狀細(xì)胞癌約占所有口腔癌的30%[1]。舌鱗狀細(xì)胞癌具有生長快、浸潤性強(qiáng)的特點(diǎn)，5年存活率約60%[2]。局部復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是舌鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后差的主要因素。因此，闡明舌鱗狀細(xì)胞癌遷移和侵襲的分子機(jī)制和確定其治療靶點(diǎn)，對(duì)于臨床診斷和治療至關(guān)重要。

法尼基轉(zhuǎn)移酶（farnesyltransferase，F(xiàn)Tase）是由FNTA基因編碼的α亞單位和FNTB基因編碼的β亞單位組成[3]。FTase識(shí)別RAS蛋白的C末端CAAX基序，并將法尼基二磷酸中的法尼基團(tuán)轉(zhuǎn)移至CAAX基序中的半胱氨酸巰基上[4]。這一步是RAS蛋白的細(xì)胞膜定位和生物活性發(fā)揮所必不可少的[5-6]。法尼基化的RAS蛋白相當(dāng)于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的開關(guān)，RAS蛋白在腫瘤的形成和發(fā)展過程中起重要作用[7-9]，RAS蛋白控制細(xì)胞信號(hào)通路參與細(xì)胞生長、遷移、黏附、細(xì)胞骨架完整性、生存和分化等功能[10-11]。口腔癌中RAS基因以HRAS突變較為常見，HRAS基因突變和擴(kuò)增分別約為11.2%和13.8%[12]。由于HRAS只能被FTase修飾[13-14]，因此針對(duì)口腔癌HRAS突變或高表達(dá)患者，抑制FTase功能進(jìn)行抗腫瘤治療可能具有一定的療效，然而在口腔最常見惡性腫瘤舌鱗狀細(xì)胞癌中，這方面的研究相對(duì)較少。研究顯示，核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）與HRAS致癌基因激活的異常細(xì)胞增殖和致瘤性密切相關(guān)[15-16]，而NF-κB可調(diào)控侵襲相關(guān)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)[17]。通過檢索Oncomine數(shù)據(jù)庫中FTase β亞單位編碼基因FNTB，其癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）頭頸鱗狀細(xì)胞癌數(shù)據(jù)集中顯示FNTB與低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的共表達(dá)相關(guān)系數(shù)為0.982，表明FNTB與HIF1α表達(dá)相關(guān)性很高。

研究[18-19]表明，在口腔癌中HIF1α調(diào)控血管生成和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)。本研究利用RNA干擾技術(shù)，以人舌鱗狀細(xì)胞癌CAL27和SCC-4細(xì)胞為研究對(duì)象，通過舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系體外實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)抑制FTase是否會(huì)影響NF-κB的p65亞單位的磷酸化和通過HRAS下游的NF-κB通路影響細(xì)胞的侵襲，此外還檢測(cè)抑制FTase是否會(huì)影響HIF-1α的表達(dá)和血管生成，探討沉默F(xiàn)Tase對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌遷移和侵襲的影響及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系CAL27購自中南大學(xué)高等研究中心， SCC-4由山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院饋贈(zèng)。

DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清（BI公司，以色列），胰蛋白酶（Gibco公司，美國），RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×Sybr Green qPCR Mix（北京艾德萊生物科技有限公司），青霉素、鏈霉素（Gibco公司，美國），二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）（Amersco公司，美國），小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）片段設(shè)計(jì)、合成及riboFECTTMCP轉(zhuǎn)染試劑（廣州銳博生物科技有限公司）。兔抗人多克隆抗體HIF-1α、VEGF、FTase、HRAS和鼠抗人單克隆抗體p65（Affinity Biosciences公司，美國），兔抗人多克隆抗體p-p65 (S536)、MMP-9、GAPDH、羊抗兔IgG二抗、羊抗鼠IgG二抗（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司），Transwell小室（Corning公司，美國），RIPA（radio immunoprecipitation assay）裂解液（北京索萊寶生物科技有限公司）。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物FTase、HRAS、GAPDH由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清、青霉素100 U·mL-1和鏈霉素100 mg·mL-1的DMEM培養(yǎng)基，放于37 ℃、5%CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿瓶底約90%后，進(jìn)行消化，以1∶2的比例接種至新的培養(yǎng)瓶中。

1.3 siRNA轉(zhuǎn)染

針對(duì)FTase基因序列設(shè)計(jì)3條FTase-siRNA（表1）和1條陰性對(duì)照序列。轉(zhuǎn)染前1 d以每孔5×105個(gè)舌鱗狀細(xì)胞癌CAL27和SCC-4細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)30%～50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用120 μL ribo-FECTTMCP Buffer稀釋8 μL 20 μmol·L-1siRNA儲(chǔ)存液（轉(zhuǎn)染時(shí)siRNA終濃度為80 nmol·L-1），室溫孵育 5 min。加入12 μL riboFECTTMCP轉(zhuǎn)染試劑，輕輕吹打混勻，加入到1 860 μL更新的無雙抗完全培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染后48 h檢測(cè)基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分為3組：實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組。其中實(shí)驗(yàn)組為3個(gè)FTase-siRNA轉(zhuǎn)染組，分別轉(zhuǎn)染3條FTase-siRNA；陰性對(duì)照組為NC-siRNA轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染NC-siRNA；空白對(duì)照組僅加入等量轉(zhuǎn)染試劑，不轉(zhuǎn)染任何siRNA。

表 1 針對(duì)FTase基因序列設(shè)計(jì)3條FTase-siRNATab 1 Three FTase-siRNA sequences designed for FTase gene

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞FTase、HRAS 的mRNA表達(dá)

轉(zhuǎn)染24 h后，提取各組細(xì)胞總RNA，紫外光分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度和濃度。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以合成cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR。FTase的引物序列：上游5’-GGTGGATGTGAGAAGCGCATA-3’，下游5’-GGCCAGGCCACAGAAGGTATA-3’；HRAS的引物序列：上游5’-GGCAGGAGACCCTGTAGGAG-3’，下游：5’-GGTTCACCTGTACTGGTGGAT-3’；GAPDH的引物序列：上游5’- GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，然后95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸31 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和數(shù)據(jù)分析由ABI PRISM 7000實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自動(dòng)完成，采用2-ΔΔCt公式計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，其中Ct值為循環(huán)閾值。選取3個(gè)FTase-siRNA轉(zhuǎn)染組中沉默效率最高的一組作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)行進(jìn)一步研究。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)目的蛋 白的表達(dá)

siRNA轉(zhuǎn)染48 h后，提取各組細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，應(yīng)用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。100 ℃變性10 min，每泳道50 μg蛋白，在10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離后，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h。加入一抗[FTase，1∶1 000；HRAS，1∶1 000；p65，1∶1 000；p-p65 (S536)，1∶500；MMP-9，1∶500；HIF-1α，1∶ 1 000；VEGF，1∶1 000]，在4 ℃下孵育過夜。用TBST洗滌后，將膜與二抗（1∶10 000）在室溫下?lián)u床孵育1 h。加入電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）液顯色、曝光。以測(cè)定蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示其蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力

將鋪好人工基質(zhì)膠Transwell侵襲小室置于室溫，上室和下室各加入0.5 mL的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，置37 ℃培養(yǎng)箱中水化2 h。將轉(zhuǎn)染48 h的舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞消化后，用無血清培養(yǎng)液調(diào)整為8×104個(gè)·mL-1的細(xì)胞懸液。Transwell上室中加入500 μL細(xì)胞懸液，下室中加入750 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。然后用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗，用棉簽輕輕拭去上層未遷移細(xì)胞，置于甲醛室溫固定15 min，吸干上室固定液，置于0.1%結(jié)晶紫中室溫染色20 min。蒸餾水沖洗后，顯微鏡下拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力

用記號(hào)筆于6孔板背部間隔0.5～1.0 cm畫5條橫線。將轉(zhuǎn)染24 h細(xì)胞（每孔5×105個(gè)細(xì)胞）接種在6孔板上。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%匯合時(shí)，用200 μL槍頭垂直背部橫線劃痕。然后用PBS沖洗3次，加入無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別于劃痕的0、24、48 h觀察并拍照測(cè)定細(xì)胞遷移能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。24 h劃痕相對(duì)愈合面積=（0 h劃痕面積-24 h劃痕面積）/ 0 h劃痕面積，48 h劃痕相對(duì)愈合面積=（0 h劃痕面積-48 h劃痕面積）/0 h劃痕面積[20]。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0對(duì)結(jié)果行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料的組間比較用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞FTase、HRAS的mRNA表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)顯示，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組FTase mRNA表達(dá)下降（P＜ 0.05）（圖1）。各個(gè)實(shí)驗(yàn)組間FTase mRNA表達(dá)比較，以FTase-siRNA-3組的沉默效率最高，作為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)一步研究。各組HRAS的mRNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.2 各組細(xì)胞FTase、HRAS的蛋白表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞FTase的蛋白表達(dá)下降（P＜0.05），HRAS的蛋白表達(dá)無明顯變化（P＞ 0.05）（圖2）。

2.3 各組腫瘤侵襲和血管生成相關(guān)蛋白的表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組p-p65(S536)、MMP-9、HIF-1α和VEGF的蛋白表達(dá)下降（P＜0.05），p65的蛋白表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）（圖3、4）。

2.4 各組細(xì)胞的侵襲能力

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞通過Matrigel膠遷移到小室膜下的數(shù)量降低，表明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞侵襲能力降低（P＜0.05）（圖5）。

圖 1 各組細(xì)胞FTase、HRAS mRNA的表達(dá)Fig 1 Expression of FTase and HRAS mRNA in each group

圖 2 各組細(xì)胞FTase、HRAS蛋白的表達(dá)Fig 2 Expression of FTase and HRAS protein in each group

2.5 各組細(xì)胞的遷移能力

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6。實(shí)驗(yàn)組24 h和48 h劃痕相對(duì)愈合面積低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜ 0.05），表明實(shí)驗(yàn)組遷移能力降低（圖6）。

3 討論

舌鱗狀細(xì)胞癌是最常見的口腔癌，生長快、浸潤性強(qiáng)、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，是導(dǎo)致舌鱗狀細(xì)胞癌患者死亡率高的重要原因。因此，深入探討其侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制意義重大。RAS家族成員（HRAS、KRAS、NRAS）是人類癌癥中最常見的突變癌基因。亞洲人群口腔癌中以HRAS突變率最高，而西方國家頭頸鱗狀細(xì)胞癌（包括口腔癌）患者中HRAS的突變率較低（低于5%）[12,21]。HRAS基因的突變和高表達(dá)可成為啟動(dòng)腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵因素[22]。此外，有研究[23-24]表明，HRAS不僅在實(shí)體瘤的發(fā)生中起作用，而且在腫瘤維持中也起著重要作用。McDonald等[25]研究發(fā)現(xiàn)，HRAS的表達(dá)與頭頸鱗狀細(xì)胞癌更大的瘤體和更晚的腫瘤分期相關(guān)，預(yù)示著預(yù)后不良。

圖 3 CAL27細(xì)胞轉(zhuǎn)染FTase-siRNA后各組蛋白的表達(dá)Fig 3 The protein expression of each group after FTase-siRNA transfection of CAL27 cells

圖 4 SCC-4細(xì)胞轉(zhuǎn)染FTase-siRNA后各組蛋白的表達(dá)Fig 4 The protein expression of each group after FTase-siRNA transfection of SCC-4 cells

Ras蛋白必須通過翻譯后修飾與細(xì)胞膜結(jié)合，才能獲得其致癌活性。1995年Kohl等[26]動(dòng)物研究表明，在HRAS突變的轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺和唾液腺腫瘤中應(yīng)用FTase抑制劑可抑制腫瘤的生長。另有研究[27]表明，基因敲除GGTase-Ⅰ或FTase可抑制KRAS誘導(dǎo)小鼠肺癌發(fā)展，延長小鼠生存時(shí)間。令人遺憾的是，已進(jìn)入三期臨床試驗(yàn)的兩種FTase抑制劑（lonafarnib和tipifarnib）無論是單獨(dú)還是聯(lián)合卡鉑、紫杉醇或吉西他濱都無法改善晚期胰腺癌、晚期結(jié)腸癌、晚期非小細(xì)胞肺癌或急性髓系白血病的預(yù)后。由于KRAS或NRAS可以被二牛龍牛兒基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ旁路修飾，而HRAS只能被FTase修飾[28]。所以這種差異的原因可能是進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)這些患者腫瘤多是與KRAS或NRAS突變有關(guān)而非與HRAS突變有關(guān)。對(duì)于HRAS突變或高表達(dá)的口腔癌應(yīng)用FTase抑制劑可能有較好的臨床療效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，體外沉默F(xiàn)Tase后，HRAS的mRNA和蛋白表達(dá)無明顯變化（P＜0.05）。推測(cè)其原因是FTase主要影響HRAS的法尼基化修飾和膜定位，并不影響HRAS的表達(dá)。

圖 5 轉(zhuǎn)染FTase-siRNA后細(xì)胞侵襲能力的檢測(cè)Fig 5 Evaluation of cell invasion after FTase-siRNA transfection

圖 6 轉(zhuǎn)染FTase-siRNA后細(xì)胞遷移能力的檢測(cè)Fig 6 Evaluation of cell migration after FTase-siRNA transfaction

MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的一員，屬于Ⅳ型膠原酶，可以降解基底膜的必要成分Ⅳ型膠原和層黏連蛋白，因此被認(rèn)為是癌癥進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，在乳腺癌、胰腺癌和舌癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[29]。研究[30]表明，洛伐他汀通過抑制RAS翻譯后修飾和功能，可以抑制NIH3T3和v-H-Ras轉(zhuǎn)化的NIH 3T3成纖維細(xì)胞的侵襲和MMP-9表達(dá)。其機(jī)制被認(rèn)為是洛伐他汀通過降低受Ras調(diào)控的啟動(dòng)子元件AP-1和NF-κB的結(jié)合活性來影響MMP-9基因表達(dá)，然后抑制MMP-9活性和細(xì)胞侵襲。此外，應(yīng)用FTase抑制劑manumycin A同樣可抑制NIH3T3和v-HRas轉(zhuǎn)化的NIH 3T3的侵襲和MMP-9表達(dá)。Takada等[31]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Tase抑制劑SCH66336可通過抑制IκB磷酸化和降解來抑制NF-κB活化。NF-κB已被證明與HRAS致癌基因激活的異常細(xì)胞增殖和致瘤性密切相關(guān)[15-16]。Ras的過度表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的NF-κB活化[31]。研究[32]發(fā)現(xiàn)，在頭頸鱗狀細(xì)胞癌中抑制NF-κB后，與細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白質(zhì)MMP-9和VEGF表達(dá)降低。哺乳動(dòng)物NF-κB家族有5種蛋白，分別為RelA(p65)、RelB、c-Rel、p50(NF-κB1)、p52 (NF-κB2)。最常見的NF-κB二聚體是RelA(p65)和p50組成的異二聚體[33]。p65磷酸化可能是有轉(zhuǎn)錄能力核NF-κB所必需的[34-35]。本研究顯示，沉默F(xiàn)Tase后，細(xì)胞遷移和侵襲能力降低，p65蛋白表達(dá)量不變，p-p65(S536)、MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)降低。筆者推測(cè)沉默F(xiàn)Tase后，HRAS翻譯后修飾和功能受到抑制，并通過下游NF-κB通路影響了細(xì)胞侵襲。

Oncomine數(shù)據(jù)庫（http://www.oncomine.org）是目前世界上最大的腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)庫和整合數(shù)據(jù)提取平臺(tái)。通過檢索Oncomine數(shù)據(jù)庫中FTase β亞單位編碼基因FNTB，其TCGA頭頸鱗狀細(xì)胞癌數(shù)據(jù)集中顯示FNTB與HIF1α的共表達(dá)相關(guān)系數(shù)為0.982，其相關(guān)系數(shù)較接近1，表明FNTB與HIF1α表達(dá)相關(guān)性很高。舌鱗狀細(xì)胞癌是頭頸鱗狀細(xì)胞癌中常見惡性腫瘤之一，推測(cè)在舌癌中，F(xiàn)NTB與HIF1α可能也有很高的表達(dá)相關(guān)性。研究[36]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Tase抑制劑SCH66336在低氧、胰島素樣生長因子（insulin like growth factor，IGF）刺激和未刺激的非小細(xì)胞肺癌和頭頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中均表現(xiàn)出抗血管生成活性，并降低HIF-1α和VEGF的表達(dá)。但FTase調(diào)控HIF-1α和VEGF表達(dá)的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。此外，研究[18-19]表明，在口腔癌中HIF1α調(diào)控血管生成和VEGF的表達(dá)。本研究顯示，沉默F(xiàn)Tase后，HIF-1α和VEGF的表達(dá)降低，表明在舌鱗狀細(xì)胞癌中FTase可能通過調(diào)控HIF-1α影響血管生成。

綜上所述，本研究通過舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系體外實(shí)驗(yàn)顯示，沉默F(xiàn)Tase可能通過HRAS下游的NFκB通路影響了細(xì)胞的侵襲，并通過對(duì)HIF-1α的調(diào)控影響血管生成。這提示，F(xiàn)Tase在舌鱗狀細(xì)胞癌的侵襲和血管生成中起著一定調(diào)控作用，進(jìn)一步研究FTase具體作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制，有利于為控制舌鱗狀細(xì)胞癌侵襲和血管生成進(jìn)行靶向治療提供重要證據(jù)。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。